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Method Article
O biarsenical corantes Flash e ReAsH se ligam especificamente a motivos tetracysteine em proteínas e pode seletivamente rótulo proteínas em células vivas. Recentemente, esta estratégia de rotulagem tem sido usado para desenvolver sensores de conformações de proteínas diferentes ou estados oligoméricos. Descrevemos a abordagem rotulagem e métodos para analisar quantitativamente vinculativo.
Proteínas fluorescentes e corantes são ferramentas essenciais para o estudo da localização de proteínas, tráfico e função nas células. Enquanto que as proteínas fluorescentes, como a proteína fluorescente verde (GFP) têm sido amplamente utilizados como parceiros de fusão para proteínas para monitorar as propriedades de uma proteína de interesse 1, os desenvolvimentos recentes com etiquetas menores permitem novas funcionalidades de proteínas a ser examinada em células, tais como mudança conformacional e proteína-associação 2, 3. Um sistema de tag pequenas envolve um motivo tetracysteine (CCXXCC) geneticamente inserido em uma proteína-alvo, que se liga aos corantes biarsenical, ReAsH (vermelha fluorescente) e Flash (verde fluorescente), com alta especificidade, mesmo em células vivas 2. O TC / biarsenical sistema de corante oferece muito menos restrições estérico à proteína do hospedeiro do que proteínas fluorescentes que tem possibilitado várias novas abordagens para medir a mudança conformacional e interações proteína-proteína 4-7. Recentemente, desenvolveu uma nova aplicação de tags TC como sensores de oligomerização em células que expressam mutante, que quando sofre mutação agregados nos neurônios em Huntington doença 7. Huntingtina foi etiquetado com dois corantes fluorescentes, uma uma proteína fluorescente para rastrear a localização de proteínas, e um segundo a marca TC que obriga apenas corantes biarsenical em monômeros. Assim, mudanças na co-localização entre as proteínas e reatividade corante biarsenical habilitado conteúdo oligômero submicroscópicas ser espacialmente mapeadas dentro das células. Aqui, descrevemos como rotular TC-tagged proteínas fundida a uma proteína fluorescente (Cherry, ou GFP PCP) com flash ou ReAsH viver em células de mamíferos e como quantificar a fluorescência de duas cores (Cherry / Flash, PCP / Flash ou GFP / combinações ReAsH).
1. Preparação de células para a rotulagem com ReAsH / Flash
Note que é importante o uso de controles positivos e negativos para avaliar a extensão da ligação específica para as tags TC, para avaliar bleedthrough de fluorescência entre os canais ao coletar micrografias confocal. Assim, para duas cores (por exemplo, o Flash / Cherry ou ReAsH / PCP ou ReAsH / GFP combinações), certifique-se as amostras são preparadas para cores simples (proteína fluorescente por exemplo, sozinho ou se possível uma proteína TC-tagged obrigado a Flash / ReAsH mas sem fluorescentes proteína)
É importante acrescentar EDT primeiro antes de adicionar Flash / ReAsH e fazer o buffer pouco antes de adicioná-lo para as células. Incubar por exatamente 30 min a 37 ° C em cultura de tecidos incubadora. Em nossa experiência vezes maior de incubação aumenta significativamente a fluorescência de fundo. Novas construções também devem ser otimizados para rotulagem tempo e Flash / ReAsH concentração (0,5-2 mM).
Após esta lavagem, as células podem ser fixadas com paraformaldeído (15 min com solução 3,2%), embora nós descobrimos que isto aumenta não-específicos de fluorescência de corantes biarsenical. Daí que geralmente a imagem de células vivas em temperatura ambiente. (Note que a fixação das células antes da rotulagem previne a ligação corante biarsenical.)
2. Imagem das células em um microscópio confocal
3. Análise dos dados
4. Resultados representativos:
O sucesso das células rotulagem com corantes biarsenical é dependente de alguns parâmetros-chave. Primeiro, o momento da marcação com corantes é crucial. Descobrimos que longos períodos de rotulagem (mais de 30 min) resulta em um alto nível de não-específica coloração de fundo. Fig. 1 mostra um resultado típico de uma forma selvagem-tipo de fragmento huntingtina (25Q) fundida ao Cerulean PCP derivados contendo um tag TC, conforme descrito anteriormente 7. Esta amostra foi manchada por 30 min com ReAsH e não há fundo mínimo na amostra sem a tag TC. Nós descobrimos que a fixação de células com fundo aumenta paraformaldeído enquanto fixação com metanol revoga a fluorescência da tag proteína fluorescente. Por isso, sempre que possível nós a imagem de células vivas. É importante notar também que a fixação préviaà rotulagem com corantes biarsenical impede sua ligação, provavelmente devido a modificações do motivo TC.
Outro fator crítico para resultados consistentes é a densidade de células. Nós descobrimos que é fundamental para as células de imagem que são distribuídas livremente e também que clumping extensa pode levar a manchas irregulares dos corantes biarsenical em diferentes células.
Figura 1. Etiquetas Tetracysteine e coloração ReAsH em células vivas transfectadas com huntingtina (exon1-25Q)-Cerulean fusões. A tag TC está localizado na junção da fusão huntingtina-Cerulean (como descrito na 7). O enredo de correlação de pixel intensidade permite uma avaliação para as diferenças de ReAsH vinculativa em toda a célula e pode ser usado para mapear mudanças na ReAsH vinculativo devido à mudança conformacional ou interações ligante.
A abordagem para localização de proteínas rótulo com uma proteína fluorescente e propriedades conformacionais com um corante segundo oferece um grande potencial para o mapeamento de onde conformações diferentes de proteínas acumulam nas células e eventos que alteram a dinâmica da conformação protéica. ReAsH / Flash foi usado primeiramente como um sensor na célula para o dobramento de proteínas dos mamíferos celular proteína ácido retinóico-binding I 4. Neste exemplo, o Flash vinculado a um ...
Não há conflitos de interesse declarados.
Este trabalho foi financiado por doações de DMH e TDM (subvenções NHMRC projeto). DMH é um companheiro Grimwade, financiado pelo Fundo Miegunyah.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nome do reagente | Companhia | Número Catálogo | Comentários |
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8-μ bem-slides | Ibidi | 80826 | Encontramos estas câmara de slides a ser particularmente útil para a cultura de células para geração de imagens. |
TC-FLASH II na célula Detecção Tag Tetracysteine Kit * * * fluorescência verde para a imagem latente em células vivas | Invitrogen | T34561 (Flash) ou T34562 (ReAsH) | |
Solução de Hanks salina balanceada | Invitrogen | 14175-103 | |
2,3-dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5mL | |
1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
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