Farmacológica e funcional Ensaios genética para manipular Regeneração da planária Dugesia japonica</em

Resumo

Um modelo atraente para estudar a diferenciação das células-tronco dentro de um animal vivo é o platelminto planária. Regeneração é estudado por experimentos amputação simples que são facilmente realizados em um laboratório básico e são passíveis de (farmacológicos e genéticos In vivo RNAi) manipulação, conforme detalhado por protocolos neste artigo.

Resumo

Platelmintos de vida livre planária tem uma longa história de uso experimental, devido às suas notáveis ​​capacidades regenerativas ^1. Pequenos fragmentos retirados de estes animais reformar o plano de corpo original após a regeneração das estruturas do corpo faltando. Por exemplo, se um fragmento "tronco" é cortado a partir de um verme intacta, 'cabeça' de um novo vai gerar anteriormente e um 'rabo' vai gerar posteriormente restaurar o original polaridade "head-to-tail" das estruturas do corpo antes da amputação (Figura 1A).

Regeneração é impulsionado por células-tronco em planárias, conhecido como "neoblasts 'que se diferenciam em ~ 30 diferentes tipos de células durante a homeostase corporal normal e regeneração de tecidos aplicadas. Este processo regenerativo é robusto e fácil de demonstrar. Devido à dedicação de vários laboratórios pioneiros, muitas ferramentas e métodos genéticos funcionais já foram otimizados para o sistema modelo. Conseqüentemente, os progressos recentes considerável tem sido feito na compreensão e manipulação dos eventos moleculares subjacentes à plasticidade do desenvolvimento planária ^2-9.

O sistema modelo planária serão de interesse para uma ampla gama de cientistas. Para os neurocientistas, o modelo oferece a oportunidade de estudar a regeneração de todo um sistema nervoso, ao invés de simplesmente a regeneração / reparação de processo único de células nervosas que normalmente são foco de estudo em muitos modelos estabelecidos. Planárias expressar uma infinidade de neurotransmissores ^10, representam um importante sistema para o estudo da evolução do sistema nervoso central ^{11, 12} e têm potencial de triagem comportamental ^{13, 14.}

Regenerativa resultados são passíveis de manipulação por apparoaches farmacológicos e genéticos. Por exemplo, as drogas podem ser rastreados para efeitos sobre a regeneração simplesmente colocando fragmentos do corpo em soluções contendo droga em diferentes momentos após a amputação. O papel de genes individuais pode ser estudada usando métodos knockdown (in vivo RNAi), que pode ser conseguido através de ciclos de microinjeção ou alimentando-bacterially expressa constrói dsRNA ^{8, 9, 15.} Ambas as abordagens podem produzir fenótipos visualmente impressionante em alta penetrância, por exemplo, regeneração de animais bipolar ^16-21. Para facilitar a adoção deste modelo e implementação de tais métodos, nós apresentamos neste artigo vídeo protocolos para ensaios farmacológicos e genéticos (RNAi in vivo pela alimentação), utilizando o planária Dugesia japonica.

Protocolo

1. Tronco ensaio de regeneração do fragmento

1. Parar de alimentar uma coorte de worms por pelo menos cinco dias antes do ensaio regenerativa para garantir os animais são livres de resíduos e alimentos ingeridos (~ 30 worms intactos, cada minhoca ~ 8-10 mm de comprimento pós-inanição).
2. No dia do ensaio, lavar um prato pré-congelado de gelo nivelado com água e cobrir a superfície plana gelada com filme plástico. Utilizando uma pinça, coloque um filtro de papel sobre o plástico.
3. Umedecer o papel de filtro com algumas gotas de água de nascente. Transferência de planárias em filtro (<20 worms por filtro), utilizando uma pipeta. Worms pode ser reposicionada no filtro, se necessário, por repipetting com água mais primavera. Retire o excesso de fluido.
4. Usando um bisturi, amputar a cabeça por um único corte feito aproximadamente a meio caminho entre o ápice anterior do animal e da extremidade anterior da faringe (Figura 1A).
5. Usando um bisturi, amputar a região da cauda por um único corte feito aproximadamente a meio caminho entre o fim da cauda do animal e extremidade posterior da faringe (Figura 1A). Retire o excesso de muco no bisturi usando uma toalha de papel umedecido com álcool 70% após o corte. Limpe o excesso de etanol bisturi.
6. Transferência do filtro através de pinças em uma placa de Petri (100 x 25mm profundidade) contendo água de nascente. Espere ~ 3 minutos (para o fechamento da ferida, observável por um beliscar e escurecimento da ferida).
7. Enxágüe tronco a partir de fragmentos de papel de filtro para placa de Petri contendo meio desejado para o ensaio de regeneração e transferência para termostatizado incubadora (24 ° C).
8. Pontuação fenótipo regenerativa após ~ 1 semana, quando as estruturas regeneradas são identificáveis ​​(Figura 1A).

2. Manipulação farmacológica da regeneração: bipolaridade induzida por praziquantel

1. Prepare estoque praziquantel (PZQ) por droga solubilização em DMSO (62.4mg PZQ em 1mL de ações 200mM). Use no mesmo dia.
2. Faça 50mL de drogas contendo solução (90 mM PZQ) em sais Montjuch buffered. Vortex de ~ 1 minuto para garantir a dispersão.
3. Realizar ensaio de tronco regenerativas fragmento como detalhado acima [protocolo n º 1], expondo uma coorte de fragmentos tronco para PZQ na etapa final [1,7].
4. Após 24-48 horas, a troca PZQ contendo mídia para água mineral, lavar várias worms (> 3) vezes.
5. Retorno worms para incubadora. Bipolaridade pontuação (dois-cabeças, Figura 1B) uma semana após o corte.

3. Manipulação genética de regeneração: in vivo protocolo de alimentação RNAi

1. Antes do ensaio, prepare homogeneizado de fígado de galinha. Descartar graxos, amarelo seções coloridas de estoque de alimentos, e purê de fígado remanescente. Filtro de puré através da malha do filtro e suspensão alíquota para armazenamento (1,5 ml tubos, -20 ° C).
2. Antes do ensaio, prepare bovina glóbulos vermelhos (hemácias) por alíquotas de fornecimento em amostras de 1 mL, armazenadas a -20 ° C.
3. Selecione worms para RNAi. Três coortes são usados: o gene de interesse, controle positivo (gene com fenótipo RNAi conhecidos; Figura 1C, D & E) e controle negativo (gene sem fenótipo RNAi, também útil para avaliação dos níveis de knockdown em relação ao grupo experimental). Para cada coorte, use ~ 250 worms (~ 8-10 mm de comprimento após passar fome durante pelo menos 5 dias). Loja em água de nascente na banheira de plástico.
4. Para cada RNAi estoque descongelar coorte, de E. coli expressando dsRNA gene targeting de interesse [8], juntamente com um tubo de homogenato de fígado de frango [3.1] e um tubo de hemácias [3.2].
5. Pellet de bactérias (13.000 g, 1 minuto). Remover o sobrenadante e ressuspender sedimento em 2xYT media (~ 700μl). Recentrifuge, elimine o sobrenadante, coloque pellet no gelo.
6. Criar um grande furo P200 ponteira cortando o final da ponta. Completamente ressuspender o sedimento de bactérias em uma mistura de fígado de galinha homogenato (150 mL) e hemácias (50 mL) para criar RNAi mix de alimentação. Remover bolhas de ar por centrifugação.
7. Para a alimentação, retire a maior parte da água da banheira de plástico contendo worms (leave ~ profundidade de 1 polegada). Tub redemoinho de concentrar worms no centro deste recipiente e misturar a alimentação pipeta RNAi em um círculo corralling worms. Use uma pipeta com cuidado coaxial fugitivos de volta para o mix de alimentação RNAi sem perturbar outros clientes!
8. Após a alimentação (~ 1 hora), identificar planárias que alimentou bem. Esses vermes mostram uma coloração vermelho profundo de hemácias ingerido. Descartar outros.
9. Recolocá alimentação solução com água fresca, minimizando distúrbios para evitar egestion de alimentos. Para fazer isso, gentilmente localizar os worms para um lado do tubo com uma pipeta de transferência, derramar água turva, e recolocá com água fresca derramadas na parede oposta da banheira. Planárias Resubmerge mais rapidamente a exposição prolongada ao ar também resulta em egestion alimentos.
10. Vagamente sial tampa do recipiente e retornar à incubadora (24 ° C)
11. Repita RNAi protocolo de alimentação durante vários ciclos (~ 2-3 dias de intervalo), intercalados com ciclos regenerativos [protocolo # 1] para triagem de fenótipos RNAi. Um protocolo padrão de alimentação e de regeneração eficaz para muitos genes é mostrado na Figura 2, que leva ~ 1 mês de duração total.

Modificar este esquema para genes diferentes, como protocolo ideal dependerá de fatores como a estabilidade do RNAm, a localização do tecido, perdurance proteína, ou o desenvolvimento de um fenótipo que impede os ciclos de alimentação múltiplas após a regeneração. Avaliar os níveis de knockdown simplesmente triagem para penetrância do fenótipo (se aparente), ou por abordagens qPCR comparar os níveis de mRNA alvo de grupo de controlo negativo.

4. Resultados representativos:

O tronco ensaio regeneração fragmento é tão forte que todos os vermes deve regenerar normais ântero-posterior ("cabeça à cauda) polaridade. Isto pode ser marcado assim que cinco dias após o corte, facilitada pelo surgimento da eyespots anterior (asterixed, Figura 1A). No entanto, a restauração completa das estruturas morfológicas perdido ocorre após uma semana. Manipulação farmacológica da regeneração fragmento de tronco por PZQ para produzir duas cabeças worms (Figura 1B) também é robusta (EC ₅₀ = 87 (+ -) 11% fragmentos bipolar, 70μM PZQ por 48 horas ^20). Bipolaridade ocorre ao longo de um único ciclo regenerativo. Menor eficácia nestes ensaios provavelmente relacionado a problemas com a solubilidade de drogas e / ou armazenamento, ou o uso de uma espécie diferente, onde platelminto PZQ é ineficaz. De drogas com menor penetrância, um índice anteriorização é muitas vezes usado para marcar fenótipos intermediários para além de ²² bipolaridade completa. Fenótipos resultantes de RNAi de construções de controle positivos são mostrados na Figura 1: RNAi de Dugesia japonica seis-1 (D j e seis-1) resulta em um fenótipo eyeless ²³ (Figura 1C), RNAi de Dugesia PC2 japonica (Dj-PC2) resulta em uma perda da resposta aversão a luz ²⁴ (Figura 1D) e RNAi de Dugesia japonica βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1) resulta em um fenótipo de duas cabeças ^{16-19, 21} a partir de fragmentos do tronco (Figura 1E). Estes fenótipos pode ser conseguido usando os seguintes protocolos de RNAi simples: Dj e seis-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), onde F = ciclo de alimentação e x = ciclo regenerativo, respectivamente.

Figura 1:... Trunk ensaio de regeneração fragmento de A Esquerda, Imagem do planária (topo) e esquema (meio) para mostrar a posição do fragmento retirado do tronco direito, timecourse de regeneração fragmento de tronco mostrando a aparência de um fragmento de regeneração, por vezes indicado (dias) B imagem de duas cabeças planária produzida pela exposição PZQ. verme C 'Eyeless "produzido pelo Dj e seis-1 RNAi. D Perda de resposta de aversão a luz no imóvel Dj-PC2 RNAi worms (manchada de vermelho), em comparação com o controle sem-fim móvel (manchada verde). E Bipolar planária produzido por Dj-βcatenin-1 RNAi. No BE, o final original anterior dos vermes RNAi é orientado para a esquerda.

Figura 2: Seqüência de ciclos de alimentação e corte de protocolo de RNAi típico composto por múltiplas refeições (F), e os ciclos de regeneração (x) que é eficaz para knockdown de muitos genes em D. japonica. Modificação do presente protocolo para genes individuais pode ser necessária para produzir os melhores resultados, por exemplo usando um arquivo. Menores (entre parênteses) ou um número maior de alimentação e ciclos de regeneração

Discussão

Os protocolos descritos aqui detalhadamente os ensaios para o estudo e manipulação de regeneração da planária Dugesia japonica. Eles são simples e não requerem equipamento especializado de modo que possam ser facilmente realizado no laboratório ou sala de aula. Ensaios podem ser realizados individualmente ou combinados (químicos para rastreamento genético de eficácias de drogas in vivo) e pode ser realizada ao nível de genes candidatos, ou são adaptáveis ​​a throughput screening imparcial, acima de ^8. Se para o estudo da biologia de planárias intrigante em seu próprio direito, ou para a avaliação in vivo em função de homólogos mamíferos em um modelo alternativo para estudar a regeneração do tecido, estas abordagens devem catalisar o interesse de uma gama diversificada de pesquisadores.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente	Vendedor	Número Catálogo	Comentários
Água de nascente	Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN	n / a	Outras formas de água de nascente funcionar bem também. Primeiro julgamento em ensaios de viabilidade.
1 x buffered Montjuich sais: NaCl (1,6 mm), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0,1 mM), KCl (0,1 mm), NaHCO3 (1,2 mm), HEPES (1,5 mM). pH 7,4 a 24 ° C.	Múltiplos fornecedores	n / a	Água artificial para os tratamentos com drogas durante os ensaios de regeneração para garantir buffer pH. Solução 08/05 Holtfreter é uma alternativa.
2xYT Caldo	Fisher Scientific	BP2467-500	Media = 31 g / L. Autoclavado.
Petri Dish (100x25mm)	Fisher Scientific	08-757-11	Worms habitação durante os ciclos de regeneração
Praça Dish (100x100x15mm)	Fisher Scientific	08-757-11A	Encha com água, para congelar bandeja de gelo usado como superfície de corte verme
Tubo de plástico: Twist Ziploc 'n Loc (16 onças).	Vários retalhistas	n / a	Conveniente recipientes de água apertado para coortes RNAi
Fígado de frango	Mantimento comercial	n / a	Viés para suprimentos orgânicos, devido à evasão de antibióticos.
Lado Blender	Qualquer fornecedor de cozinha	n / a	Use para fazer purê de fígado de galinha
Fio de 1 milímetro de malha do filtro	Qualquer fornecedor de cozinha	n / a	Use para esticar purê de fígado de galinha
Bovina glóbulos vermelhos	Lampire Biological Laboratories	7240807	100% lavado e pooled suspensão RBC
Circular papéis de filtro	Whatman # 3	1003 055
Transferência Pipetar	Fisher Scientific	13-711-41
Estéreis, lâminas cirúrgicas	Múltiplos fornecedores	n / a
± Praziquantel	Sigma Aldrich	P4668	Alíquotas em pó armazenar no escuro a 4 ° C. Desidratar.
Dj e seis-1		GenBank AJ557022.1	RNAi para controle positivo "olho-less" fenótipo 23
Dj-βcatenin-1		GenBank AB181913.1	RNAi para controle positivo de duas cabeças fenótipo 17
Dj-PC2			RNAi controle positivo para a perda do fenótipo aversão a luz 24