Imuno-histoquímica: Seções de parafina Usando o Kit de Vectastain ABC Vector Labs

Resumo

Resumo

Imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica valiosa utilizada para localizar / visualizar a expressão da proteína em uma seção de tecido montado usando anticorpos específicos. Existem dois métodos: o método direto e indireto. Neste experimento, vamos apenas descrever o uso de coloração IHQ indiretos. Coloração IHC indireta utiliza altamente específicos primário e biotina conjugado com anticorpos secundários. Anticorpos primários são utilizados para identificar discretamente proteínas de interesse por ligação a um epítopo específico, enquanto anticorpos secundários subtrair para não-específica coloração de fundo e amplificar o sinal através da formação de complexos com o anticorpo primário. Slides podem ser gerados a partir de cortes congelados, ou parafina incorporada montados em lâminas de vidro. Neste protocolo, discutimos a preparação de parafina seções por hidratação desparafinação, usando um gradiente de álcool, a recuperação de calor antígeno induzido, e bloqueio da atividade da peroxidase endógena e não-específicas sítios de ligação. Algumas seções são então coradas com anticorpos específicos para T CD8 e marcador de células, enquanto outras estão manchadas de tirosina hidroxilase. Os slides são posteriormente tratados com anticorpos secundários conjugados apropriado para biotina, então desenvolvido utilizando conjugado avidina-peroxidase (HRP) com Diaminiobenzidine (DAB) como substrato. Na sequência do desenvolvimento, as lâminas são contracorados de contraste e montado sob lamínulas com Permount. Após a secagem adequada, estes slides estão prontas para a imagem latente.

Protocolo

Coloração de secções de parafina

1. Dewax slides com xileno (Fisher X3 ^S -4) 3x por 5 minutos cada (xileno mudam a cada mês, dependendo do uso, xileno é tóxico). Use pratos e tampas para 20 slides de Fisher ref 08-812-1A e racks feito para caber esses pratos. 200 ml de líquido por prato.
2. Hidratar por meio de gradiente de álcool da seguinte forma (mudança de gradiente a cada 2 semanas):
   • 2x em etanol 100% (Fisher # A406-20) por 2 min cada
   • 2x em etanol 95% por 2 min cada
   • 1x em etanol 70% por 2 min
   • 1x em etanol 50% por 2 min
   • 1x em etanol 30% por 2 min
   • 1x DDH ₂ O por 2 min
3. Mergulhe na DPBS por 5 min (DPBS = fosfato modificado Dulbecco Buffered Saline com Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +).}

Recuperação do antígeno:

1. Pré-aqueça o tampão a Na-Citrato (10 mM, pH 6,5) no microondas.
2. Cozinhe as lâminas durante 15 min no microondas. Os slides não devem secar para verificar cada min e adicionar Na-Citrato, quando necessário.
3. Deixe esfriar em temperatura ambiente.
4. Bloquear a atividade da peroxidase endógena com 1% de H ₂ O ₂ em DPBS por 20 min (1,5 ml de estoque 30% Sigma H-1009 em 50 DPBS ml).
5. Mergulhe na DPBS 3 x 5 min.
6. Bloco non-sites específicos por incubação durante a noite a 4 ° C em DPBS + 5% de albumina sérica bovina (BSA) + 0,1% Na Azida + 5% de soro.
   
   Nota: A escolha de soro irá depender da espécie em que os anticorpos utilizados para a coloração foram feitas. Bloco com soro de espécies em que o Ab secundário (conjugado com biotina) foi feita. Se este não estiver disponível, use soro de uma espécie diferente daquele em que o Ab primário foi feito.
   
   
7. Bloquear os sites com a biotina avidina / biotina bloqueio kit (Vector laboratórios de catalogo SP-2001):
   • Incube com Avidin D por 15 min. Lave brevemente com DPBS.
   • Incube com a solução de biotina por 15 min.
8. Incubar em Ab primário para 2 horas em temperatura ambiente, em DPBS + 2% BSA NaAzide + 0,1% + 2% de soro (o mesmo que para Bloqueio de passo).
9. Mergulhe em PBS 3 x 5 min.
10. Incube com a Ab secundário conjugado com biotina por 1 hora em temperatura ambiente + 2% + 0,1% BSA Na Azida + 2% de soro (mesmo utilizado para a etapa de bloqueio). DPBS em
11. Preparar o reagente ABC, ao mesmo tempo porque tem que desenvolver para pelo menos 30 min antes de usar! (Veja Materiais)
12. Prepare em um tubo de 50 ml. Em 15 DPBS ml (sem soro, sem azida) adicionar 3 gotas do reagente A, misturar e adicionar 3 gotas de reagente B e misturar. Evite apertar as garrafas, e não esperar que as gotas para formar por conta própria. ABC kit Vectastain PK-6100 da Vector Labs.
13. Mergulhe na DPBS 3 x 5 min.
14. Incube com reagente ABC por 30-45 min em temperatura ambiente.
15. Mergulhe na DPBS 3 x 5 min.
16. Prepare DAB substrato peroxidase (Vector Labs # SK-4100) em 5 ml DDH ₂ O num frasco de vidro imediatamente antes do uso (ver Materiais)
    • 2 gotas de solução de estoque regulador, mix
    • 4 gotas de DAB, mix (deve ficar ligeiramente marrom)
    • 2 gotas H ₂ O _2, mix
17. Soltar o substrato DAB em cima dos slides e assistir a coloração marrom.
18. Dip slides em gelo + água da torneira para parar a reação.
19. Enxágüe em água corrente fria por 5 min.
20. Contracoloração com hematoxilina (20 seg; Fisher CS401-D) e enxaguar em água corrente até que a água sai clara.
21. Desidratar através de gradiente de álcool a partir de etanol 30% até 100% de etanol (2 min cada).
22. Mergulhe em xileno 3 x 5 min.
23. Montagem com Permount (Fisher # SP15-100): ponha algumas acima a seção sobre o slide e pressione lentamente para a seção com uma lamela, sem bolhas de ar. Não mova a lamela até que esteja completamente seco, o que leva ~ 24 horas.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Scientific	X3S-4	Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC.
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Use to make EtOH gradient.
DPBS			Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+
Na-Citrate buffer			10 mM, pH 6.5
H2O2	Sigma-Aldrich	H-1009	30% stock => Dilute to 1% in DPBS
Blocking solution			DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum.
BSA
Sodium Azide			NaAzide
avidin/biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2001
Ab buffer			DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step)
ABC kit Vectastain PK-6100	Vector Laboratories
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100
ddH2O
Hematoxylin	Fisher Scientific	CS401-D	counterstain
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Slides and cover-slips			glass