Organotípica Colágeno Ensaio I: Uma Plataforma maleável para Avaliar Comportamento celular em um contexto de 3-Dimensional

Resumo

É descrito um método para a preparação de uma matriz de 3-dimensional constituído por colagénio do tipo I e fibroblastos humanos primários. Este gel organotípica serve como um substrato útil para avaliar a migração celular invasiva porque imita características básicas de estroma de tecido e é susceptível de muitas formas de microscopia.

Resumo

A migração celular é essencial para muitos aspectos da biologia, incluindo o desenvolvimento de cicatrização de feridas, as respostas celulares do sistema imunitário, e as metástases de células tumorais. A migração tem sido estudada em lamelas de vidro, a fim de tornar a dinâmica celular passíveis de investigação por microscopia de luz. No entanto, tornou-se evidente que muitos aspectos da migração de células dependem de características do ambiente local, incluindo a sua elasticidade, a composição de proteína, e do tamanho dos poros, o que não é fielmente representado por dois substratos rígidos dimensionais, tais como vidro e de plástico ^1. Além disso, a interacção com outros tipos celulares, incluindo fibroblastos do estroma ² e ^3, as células do sistema imunológico foi demonstrado desempenhar um papel importante na promoção da invasão das células cancerosas. Investigação ao nível molecular tem cada vez demonstrado que a dinâmica molecular, incluindo a resposta ao tratamento com droga, de células idênticas são significativamente diferentes quando comparados in vivo ^4.

Idealmente, seria melhor para estudar a migração de células em seu contexto que ocorre naturalmente em organismos vivos, no entanto isso não é sempre possível. Sistemas de tecidos intermédios de cultura, tais como a matriz de células derivada, matrigel, cultura organotípica (descrito aqui) de explantes de tecidos, Organóides, e xenoenxertos, são, portanto, importantes intermediários experimentais. Estes sistemas aproximados determinados aspectos de um ambiente in vivo, mas são mais passíveis de manipulação experimental, tais como o uso de linhas de células transfectadas estavelmente, regimes de tratamento de drogas, a longo prazo e de alta resolução de imagem. Tais sistemas intermediários são especialmente úteis como provar motivos para validar sondas e estabelecer parâmetros necessários para a imagem da resposta dinâmica de células e repórteres fluorescentes antes de realizar imagens in vivo ^5. Como tal, eles podem desempenhar um papel importante na redução da necessidade de experiências com o livinanimais g.

Protocolo

1. Estabelecimento de culturas de fibroblastos a partir de explantes de pele

1. 4 milímetros biópsias do perfurador adquiridos de antebraço humano são colocados em MEM suplementado 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug de estreptomicina / ml e 0,25 ng / ml Fungizone.
2. Apare qualquer gordura subcutânea e pique a biópsia em pequenos pedaços por um número de balanço 24 lâmina de bisturi de encontro ao fundo da placa de Petri.
3. Slurry lugar o tecido em um frasco de cultura de 25 centímetros de tecido com ^dois meios de fibroblastos primários de crescimento (MEM suplementado com FCS a 10%, 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 100 ug / ml, e 25 ug / ml de Fungizone) adicionado até que a superfície do balão é cobertos, mas a profundidade de líquido é insuficiente para o tecido a flutuar.
4. Seguindo três dias de incubação a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO _2, adicionar 3 ml de meio de crescimento de fibroblastos primários.
5. Após mais 3 dias imprensa mudança de incubação com novos meios de crescimento de fibroblastos primários, ou se CELls são quase confluentes podem ser divididas 1:04 em meio fresco. (Fungizone pode ser omitida a partir deste ponto).

2. Fase I - Preparação de colágeno I de caudas de ratos

Nota: Protocolo para aproximadamente 12-14 rabos de rato adolescente (frescas ou congeladas)

1. Preparar da cauda de rato, por lavagem em etanol a 70% e remover os tendões da seguinte forma:
2. Remover a pele da cauda de rato por corte a meio da cauda a partir de cima para baixo com um. Bisturi e pealing ao longo do comprimento da cauda
3. Retire do tendão do núcleo da região proximal da cauda.
4. Remover tendão em direção à região distal da cauda evitando a bainha com pinças dentadas.
5. Extrair 1 g de tendão / 250 ml de 0,5 M de ácido acético com agitação a 4 ° C durante 48 h.
6. Centrifuga-se o extracto (7500 xg) durante 30 minutos e descartar o sedimento.
7. Adicionar um volume igual de 10% (w / v) de NaCl ao sobrenadante, e agita-se durante 30-60 min.
8. Centrífuga (10.000 xg) durante 30 minutos, deitar fora o sobrenadante e re-dissolver o precipitado em 0,25 M de ácido acético em ~ relação de 1:1 por agitação durante 24 horas a 4 ° C.
9. Dialisar a solução de colagénio contra 6-8 mudanças de 6L ~ 17,5 mM de ácido acético (1 ml de ácido acético glacial por litro de água fria, a mudança 2 x ao dia).
10. Centrifugar colagénio dialisada a 30000 xg, durante 1,5 horas.
11. Remover o sobrenadante e colocar em frasco estéril.
12. Ajustar a concentração de colagénio I a ~ 2 mg / ml utilizando 0,5 mM de ácido acético a 4 ° C.

3. Fase II - Configurando a matriz 3D com fibroblastos incorporados (permitir a contratação de 8 dias).

1. Montar a mistura, utilizando reagentes de frio a 4 ° C em um frasco pré-arrefecida. Mantenha colágeno I no gelo.
2. Para um frasco de T75 confluentes de fibroblastos primários (número de células de ~ 1 x 10 ⁶⁾ a utilização:
   • 25 ml de colagénio da cauda de rato (cerca de conc 2mg/ml)
   • 3 ml de 10xMEM
   • 0,22 M NaOH: primeiro, adicionar 2 ml, em seguida, gota a gota, agitando até o colágeno fica laranja,
   • mas não de-rosa (geralmente até 3 ml). Aproximado p ^H = 7,2.
   • Nota: É importante assegurar que o meio / gel permanece neutro ou ligeiramente ácido, como os fibroblastos não irão contrair o gel, se forem expostos a condições, mesmo ligeiramente alcalinas.
3. Trypsinise os fibroblastos, girar a 400 xg durante 5 minutos e remover o sobrenadante.
4. Durante 5 minutos girar acima: Prepare 12 x 35 milímetros pratos de plástico - normalmente atingir 12 pratos de um frasco de fibroblastos / Mix de colágeno.
5. Re-suspender fibroblastos em 3 ml FCS e imediatamente adicionar à mistura de colágeno e mexa.
6. Placa de aproximadamente 2,5 ml de colagénio / f ibroblastos, por prato tão rapidamente quanto possível. Tente evitar bolhas e definição de colágeno.
7. Deixe o colagénio-se a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% CO ₂ em ar durante 10 minutos.
8. Adicionar 1 ml de fibroblastos crescemth meios (DMEM + FCS 10%).
9. Separar a matriz de colagénio / f ibroblastos dos lados do prato, usando uma pipeta.
10. No dia seguinte: Adicione 1 ml de meio de crescimento de fibroblastos (DMEM + FCS 10%).
11. Alterar mídia todos os dias. Permitir colagénio / f ibroblastos matriz para contrair durante aproximadamente 8 dias, até que eles se encaixam em um prato de 24 cavidades (Contracção de ~ 3,5 cm a 1,5 cm de diâmetro, ver Figura 1).

Nota: A concentração de colagénio deve ser ajustada de acordo com a aplicação. Quanto mais diluir a solução de colágeno, mais rápido ele será contratado pelos fibroblastos. Ligeiras diferenças na taxa de contracção será experimentada com lotes diferentes de colagénio na mesma concentração. De igual modo, as culturas de fibroblastos diferentes irão contrair os géis de colagénio em taxas diferentes, e os fibroblastos presentes mais, mais rapidamente a taxa de contracção. Concentração de colagénio e densidade de fibroblastos podem, pois, ajustado para modificar a taxa de contracção,ea densidade do final do gel de colagénio.

4. Fase II - chapeamento células de interesse no topo da matriz

Nota: Esterilizar todos os fórceps e equipamentos com etanol antes do uso.

1. Utilizando uma pinça sem corte, mova suavemente matriz contratada a 24 bem-prato. Certifique-se que não se dobra.
2. Preparar a suspensão de células de interesse em aproximadamente 4 x 10 1 ml ⁴ ml / placa e após centrifugação (trypsinising, as células de se livrar de tripsina) na parte superior da matriz. O número real de células necessárias irão variar, dependendo do tipo de células utilizado. Médio de células deve ser por meio de crescimento normal das células de interesse.
3. Permitir que as células a crescer até à confluência no topo da matriz, a cerca de 3-5 dias.

5. Fase III - A transferência da matriz para uma grade de invasão (aproximadamente 0-21 dias)

1. Corte grades de aço inoxidável para criar um tripé e autoclave antes do uso (ver Figura 2).
2. Coloque grade estéril6 prato cm, adicionar o meio de crescimento a um nível acima da grelha (aprox 10.5ml). Matriz lugar na grelha, e aspirar cuidadosamente meios de modo que o fundo da matriz esteja em contacto com os meios, mas não submersa. Isto é referido como a interface ar / líquido, o que cria um gradiente que promove a invasão. Substituir médios a cada dois dias (ver figura 2).
3. Vivo de células, utilizando imagiologia contextual células fluorescentes pode ser trabalhada, nesta fase, ou mais cedo. O colágeno fibrilar contratado ou eu posso ser fotografada usando geração de segundo harmônico (SHG, veja a Figura 3). Usando multi-fotão excitação combinada com detecção de campo amplo descobrimos que SHG pode ser trabalhada pelo menos 100 um para a matriz, enquanto que as células que expressam GFP citoplasmático pode ser trabalhada, pelo menos, 200 um de profundidade.

Nota: No que diz respeito à quantificação da invasão, o dia em que matricies são colocados sobre as grades define Dia 0. Colocação em grades gera um gradiente de meios de cultura celular que promove int invasão oa matriz. As amostras podem ser visualizados ao longo do próximo 1 - 21 dias (ou mais) para avaliar processos biológicos, tais como invasão, proliferação de sobrevivência, ou diferenciação (Veja a lista de referência).

6. Estágio IV - Fixação

1. Adicionar 5 ml de 4% de PFA em um tubo Falcon.
2. Transferir a matriz sobre uma superfície plana. Corte a matriz no meio com um bisturi limpa (como você vai estar manchando a seção transversal), levante a matriz com bisturi e transferência para a PFA 4%, corrigir durante a noite.
3. Matrizes organotípicas agora está pronto para manchar com anticorpo / mancha de escolha (veja a Figura 3).

7. Os resultados representativos:

Figura 1 Exemplo de fibroblastos convencionalmente colagénio I. Mistura de fibroblastos e colagénio de cauda de rato separada da placa de petri e deixa-se contraem ao longo de 6-8 dias.

Figura 2 "src =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/>
Figura 2 progressão ensaio organotípicas. Um esquema, de um conjunto organotípica-se e progressão. B, Exemplo de colagénio / f ibroblastos no topo da matriz de aço inoxidável, rede estéril para criar interface ar / líquido.

Figura 3 Aplicações de ensaio organotípica. A, B não-invasivos e invasivos ductais pancreáticas adenocarcinoma (PDAC) invadindo células ao longo do tempo com a matriz organotípica. C, vivendo equivalente de pele mostrando uma epiderme estratificada em um fibroblasto-contratado componente colágeno dérmico. D, C8161 invadir células de melanoma em um fibroblasto -contratado equivalente dérmica de colágeno. E, a invasão de células PDAC (verde) que interagem e invadindo com fibroblastos (vermelho) dentro da matriz organotípica. F , as células invasoras PDAC (verde) interagindo com um ambiente degradante matriz extracelular (roxo) visualizada usando multifotônica baseado em geração de segundo harmônico.

Discussão

Apresentamos aqui um método para a produção de uma matriz de 3-dimensional adequada para estudos de migração celular invasiva ^6-8. A matriz é constituída por colagénio tipo 1 fibrilhas, que são contraídas ao longo de um período de vários dias, por fibroblastos humanos primários epidérmicos. O colagénio é obtido por extracção de ácido, não digestão enzimática, o que preserva a reactividade nas extremidades poli-peptídicas e promove a reticulação das fibras de colagénio em agregados maiores mediante neutralização das condições do tampão ^9. Isso resulta em um gel reconstituído que mais de perto imita as características de colagénio in vivo e tem consequências importantes para as propriedades invasivas das células cultivadas nos géis. Não importa se fresco ou congelado material de partida é utilizado, mas a utilização de caudas de rato adolescentes é importante porque a ligação cruzada do colagénio é mais lábil em animais jovens. Colágeno I de animais mais jovens é, portanto, mais fácil de extrair e re-constitui wom maior fidelidade.

A matriz de colagénio pode ser fixadas e coradas com anticorpos dirigidos contra as células tumorais, quer invasivos ou fibroblastos estromais ^2,10 e são altamente úteis para testar a eficácia de fármacos que possam inibir a invasão ^5,6.

Embora este protocolo sugere a utilização de primários de fibroblastos de pele humana, é viável utilizar fibroblastos primários do outros tipos de tecidos, de acordo com o tipo de tecido sob investigação. Também é possível estabelecer culturas de fibroblastos imortalizados utilizando, incluindo as células que foram transfectadas estavelmente com conjugados de proteínas fluorescentes. Desta forma, ambas as células estromais e de tumor podem ser rotulados de visualizar as interacções célula-célula durante a invasão ^11.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
MEM 10x	Gibco	21430	-
NaOH	Sigma	367176-500G	Prepare estoque 0,22 M em água
FCS	PAA Laboratories	A15-101	-
35 pratos milímetros	Falcão	353001	Para a etapa 3,4
60 pratos milímetros	Falcão	353004	Para o passo 5,2
Primavera fórceps sem corte	Samco	E003/02	Dentada, não lisa
Paraformaldeído 16%	Electron Microscopy Serviços	15710	Diluir a 4% em PBS antes da utilização
Telas para cd-1, tamanho 40 mesh	Sigma	S07707-5EA	Grades de aço inoxidável, 5 por pacote
Tubagem de diálise	Medicell Internacional	7607 2295	12-14 kD
PBS	Oxoid	BR0014G	-
Ácido acético	Sigma	242853	-
24 prato bem	Falcão	353047	Para passo 4.1
Fungizone	In Vitrogen	15290018	-