Teste de susceptibilidade antimicrobiana do complexo Mycobacterium tuberculosis da Droga primeira e segunda linha de diluição em caldo em um formato de placa de microtitulação

Resumo

Testes de susceptibilidade antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis é um desafio, mas fundamental para o atendimento ao paciente. Este formato de placa de microtitulação oferece testes de 12 drogas antimicobacterianos e fornece concentração inibitória mínima (MIC) valores, o que ajudará no tratamento adequado.

Resumo

A rápida detecção de resistência aos antimicrobianos é importante no esforço para controlar o aumento da resistência do Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Testes de susceptibilidade antimicrobiana (AST) de Mtb tem sido tradicionalmente realizada pelo método de agar de proporção ou por meio de testes macrobroth em um instrumento como o BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) ou BacT / ALERT (bioMérieux, Hazelwood, MO). O método das proporções em ágar, enquanto considerado o padrão "ouro" da AST, é trabalhoso e requer o cálculo de resistência através da realização de contagem de colônias em ágar contendo drogas em relação ao livre de drogas agar. Se houver ≥ crescimento de 1% no meio de drogas que contêm, em comparação com drogas meio livre, o organismo é considerado resistente a esta droga. Os métodos macrobroth requerem instrumentação e ponto de teste de quebra ("crítica"), as concentrações da droga para os medicamentos de primeira linha (isoniazida, etambutol, rifampicina e pirazinamida). O método descrito aqui é comercialmente disponível em um formato de 96 poços de microtitulação placa [MYCOTB (TREK Diagnostics)] e contém concentrações crescentes de 12 antimicrobianos utilizados para o tratamento de tuberculose, incluindo ambos os primeiro (isoniazida, rifampicina, etambutol) e medicamentos de segunda linha (amicacina, cicloserina, etionamida, canamicina, a moxifloxacina, ofloxacina, para-aminossalicílico, rifabutina, e estreptomicina). Pirazinamida, uma droga de primeira linha, não está incluído na placa de microtitulação, devido à sua necessidade de condições de teste ácido. Vantagens do sistema de microtitulação incluem tanto a facilidade de configurar e mais rápido por sua vez em torno do tempo (14 dias) em comparação com proporção tradicionais com ágar (21 dias). Além disso, a placa pode ser configurada a partir de inóculo preparado usando o caldo de carne ou meio sólido. Desde o formato microplaca é novo e desde Mtb apresenta desafios únicos de segurança no laboratório, este protocolo irá descrever como a segurança de instalação, incubar e ler a placa de microtitulação.

Protocolo

Cada laboratório deve realizar uma avaliação de risco, em colaboração com o seu Diretor de Segurança Institucional biológica para determinar o nível de biossegurança adequado para preparação do inóculo e para a pipetagem do inóculo na placa. Em nosso laboratório, utilizamos nível de biossegurança 3 de laboratório (BSL3) práticas até as placas de microtitulação são inoculados, e selada com um selo adesivo de plástico. Estas placas são então colocados dentro de um saco plástico, que é o calor, também lacrado. Incubação e interpretação da leitura da placa de microtitulação, é realizado em um laboratório de nível de segurança 2 (BSL2).

1. Rotulagem de materiais

1. Rotular uma placa de ágar sangue, três Middlebrook 7H10 placas, Middlebrook 7H9 caldo, uma solução salina entre tubo de vidro e um talão de microtitulação placa AST com os identificadores apropriados (por exemplo, nome do paciente, número do prontuário) na BSL2.
2. Rótulo agar sangue e 7H10 banhado como "check pureza". Contagem de colônias periódica do inóculo são recomendadas para garantir que uma concentração adequada de organismos é usado no teste. Contagem de colônias quando realizada precisará ter duas das placas 7H10 rotulada com "contagem 01/01 colônia" e "Contagem de 1 / 50 colônia".

2. Preparações tecnólogo de ir para o BSL3

1. Equipamentos de proteção individual apropriado é necessário para trabalhar no BSL3 e inclui sólido frente vestido, cobrir a cabeça, luvas, propés, e um respirador. Cada instituição deverá estabelecer o seu plano de proteção respiratória própria em colaboração com a sua instituição oficial de Higiene Industrial. Em nosso laboratório, temos vários respiradores disponíveis, incluindo os respiradores purificadores de ar alimentado (PAPRs) e equipado com filtro HEPA, N95 meia-face respiradores.

3. Preparação da cabine de segurança biológica

1. No BSL3, prepare o gabinete de segurança biológica (CSB) por desinfecção da superfície e colocando uma toalha de papel embebido com desinfetante aproximadamente 6 polegadas a partir do painel de ventilação de ar.
2. Coloque um recipiente do lado esquerdo, e nephlometer pequenas e vortexer à direita.
3. Loops inoculação, pipetors e dicas são colocados ao lado da toalha de papel.
4. Coloque um rack com o organismo (em caldo ou em meio sólido) e do padrão de McFarland 0,5 na toalha de papel.

4. Calibração do nefelômetro

1. Coloque um tubo de vidro de soro fisiológico entre talão na nefelômetro e defina o instrumento para zero usando o espaço em branco entre salina.
2. Coloque o padrão de McFarland 0,5 na nefelômetro e calibrar de acordo com as instruções do fabricante.

5. Preparação do inóculo

1. Trabalhando nas colônias BSC, raspe a partir de meio sólido de uma agulha esterilizada para a solução salina tween devidamente rotulados de vidro do tubo até que um talão ≥ 0,5 McFarland padrão é obtido.
2. Inspecionar visualmente a amostra, e comparar com o padrão McFarland.
3. Amostra Vortex por 30-60 segundos.
4. Permitir que o inóculo de se contentar com 15 minutos (definir um temporizador).

6. Inoculação da placa de microtitulação

1. Ajustar o inóculo com caldo de solução salina entre usando o nefelômetro calibrado para o McFarland 0,5 em passos de 4.1 e 4.2. Este deve ser concluída dentro de 30 minutos (por especificações do fabricante).
2. Use uma pipeta 200 mL e uma longa aerosol ponta da pipeta resistente a remover 100 mL de inóculo do ^rd 03/01 TOP do tubo de soro fisiológico entre talão. Inocular o caldo Middlebrook 7H9. Lentamente vortex o caldo 7H9 inoculados por 20 segundos.
3. Remova a placa de microtitulação AST da embalagem do fabricante. Não use se o dessecante é azul ou se o pacote folha está danificado.
4. Prepare um tubo de diluição 1:50 para uso posterior na preparação da diluição 1:50 pipetando 50 mL de água estéril em um tubo estéril.
5. Com cuidado, despeje o caldo 7H9 inóculo em uma calha. Evitar a geração de aerossóis.
6. Coloque a placa de microtitulação AST com o rótulo voltado para você.
7. Use uma pipeta de 12 canais para adicionar 100 mL do inóculo em cada poço.
8. Preparar diluições para contagem de colônias:
   1. A diluição de 1 / 1 é preparado a partir do controlo positivo bem (H12) por listras 1 loop mL sobre a placa 7H10 rotulados como "01/01".
   2. A diluição de 1 / 50 é preparada através da inoculação de um loop 1 ml de controle positivo bem (H12) e rodando-o no tubo com 50 ul de tubo de água preparada anteriormente. ML raia 1 do presente de diluição para a chapa denominada "1 / 50".
9. Inocular as placas pureza da calha pipetando 50 mL em um ágar sangue devidamente rotulados e placa 7H10 e raia para o isolamento.
10. Lugarum selo adesivo na placa de microtitulação AST. Pressione firmemente cada poço para garantir vedação adequada usando o fundo branco do selo. Evitar vincos.
11. Desinfetar a placa de microtitulação esfregando-o com uma toalha de papel embebido com um desinfectante tuberculocida e placa de microtitulação lugar em um saco plástico e feche com um selo de calor ou fita.
    1. O saco de plástico serve como um recipiente secundário para garantir que todo o caldo está contido deve haver um vazamento ou derramamento do prato principal.

7. Desinfecção de materiais e cabines de segurança biológica

1. Para evitar a produção de aerossóis, coloque outra calha na parte superior da calha inoculados antes de colocar o suavemente para dentro do recipiente de descarte.
2. Desinfetar todos os materiais, incluindo nephlometer, vortexer, chapas, tubos, etc, limpando-se com um desinfectante tuberculocida e esperar o momento adequado para garantir a desinfecção de acordo com as instruções do fabricante antes de remover a partir do BSC. Por exemplo, Prospray, o desinfetante tuberculocida que usamos, requer 15 minutos para matar micobactérias.
3. Coloque o recipiente de descarte em um saco de risco biológico e vedação antes da autoclavagem.

8. Incubação

1. As placas devem ser incubadas com meio para baixo e deve ser tomado cuidado para evitar derramamento ou respingos qualquer líquido.
2. Incubar a placa AST placa de microtitulação, 7H10 e placas de ágar sangue em uma incubadora de 35-37 ° C com 5-10% CO ₂ com CO ₂ em 5-10% do laboratório BSL2.
   1. Em nosso laboratório, isso é aceitável, porque a placa é bem fechados e dentro de um saco plástico selado.
3. Não mais do que duas placas de microtitulação AST devem ser empilhadas na incubadora de acordo com as instruções do fabricante.

9. Resultados representativos

Interpretação dos resultados:

Placas de microtitulação selada AST podem ser lidos manualmente usando um espelho como uma ajuda ou com um leitor automático de placas, como a Vizion (TREK Diagnostics). As placas podem ser examinados logo 7 dias após a inoculação. Examine os poços controlar o crescimento em posições H11 e H12 para determinar se eles são positivos (ou seja, têm um depósito de células no fundo do poço). Se a poços de controlo de crescimento não são positivas, reincubate a placa e re-examinar periodicamente (por exemplo, dia 10, dia 14) até a poços de controlo de crescimento são positivas.

1. Espelho leia-se:
   1. Lugar selado AST placa de microtitulação para a plataforma;
   2. Leia poços de controlo de crescimento após 7 dias de incubação, se este for negativo, reincubate AST placa de microtitulação;
   3. Se os controles de crescimento são aceitáveis, em seguida, ler os poços de drogas que contêm. Para para cada droga, gravar primeira diluição que não tem crescimento, comparando os poços de drogas com o controle do crescimento.
   4. Crescimento aparece como turbidez ou como um depósito de células no fundo de um poço.
2. Instrumento de leitura: siga as instruções do fabricante; as instruções abaixo são um exemplo de como a leitura seria feita com a plataforma Vizion:
   1. Log in
   2. Use "MYCOTB" software placa AST.
   3. Coloque a placa selada com o código de barras voltado para o usuário. Crescimento aparece como turbidez ou como um depósito de células no fundo de um poço.
   4. Leia controla o crescimento, se este for negativo, reincubate AST placa de microtitulação; se positivo ler a placa ao tocar a tela com o primeiro poço de cada medicamento que não apresenta crescimento.

Leia as placas pureza. A placa de ágar sangue não deve apresentar crescimento após 48 horas ea placa de pureza 7H10 deve ter crescimento confluente de um tipo de organismo. Se contaminados, o teste de microtitulação AST precisa ser repetido a partir de uma cultura pura.

Calcule contagem de colônias a partir do controle positivo bem usando a tabela abaixo:

Chave Contagem de Colônia

# Colônias contou com placa rotulados como "01/01"	# Colônias contou com placa rotulado como "1 / 50"	Inóculo Contagem de Colônia (UFC / mL)
<50	0	<5 X 10 4
5-10	0-2	5 X 10 4 a 1 x 10 5
> 100	≤ 10	1 X 10 5 de 5 X 10 5
> 100	> 10	> 5 X 10 5

Pode haver fuga com para-aminossalicílico em algumas cepas de Mycobacterium tuberculosis. Isto pode ser interpretado, olhando para todos os poços que têm pellets e usando o primeiro poço que tem o mesmo tamanho da pelota como a diluição seguinte como o ponto final. A resistência é rara com este medicamento.

Figura 1. Resultados representativos usando a placa MYCOTB.

Abreviatura de drogas	Droga	Μ MIC / mL
OFL	ofloxacina	16
MXF	moxifloxacina	8
RIF	rifampicina	> 16
AMI	amicacina	0,5
STR	estreptomicina	16
RFB	rifabutina	8
PAS	p-aminossalicílico	≤ 0,5
ETH	etionamida	5
CYC	cicloserina	4
INH	isoniazida	2
KAN	canamicina	1,2
EMB	etambutol	4,0

Discussão

Um exemplo de uma placa de microtitulação AST que controla o crescimento positivo é mostrado na Figura 1 e do MIC endpoint (mg / ml) para cada droga é um círculo. Um estudo realizado em nosso laboratório indicaram que a placa de microtitulação AST método é equivalente ao método de proporção padrão agar ouro para testes de susceptibilidade do Mycobacterium tuberculosis. Mais rápido relato dos resultados foi obtida com microtitulação placa de microtitulação AST quando comparado ao método tradicional agar proporção com a interpretação final para AST placa de microtitulação e método das proporções em ágar 14 e 21 dias, respectivamente.A AST placa de microtitulação tem a vantagem de testar primeiro e segunda linha de medicamentos simultaneamente, o que pode ajudar a prevenir morosidade excessiva com cepas resistentes. O AST placa de microtitulação também é muito mais fácil de configurar e ler que a APM e ambos espelho um manual e um sistema semi-automático como o Vizion pode ser usado para ler as placas. A disponibilidade de um valor de MIC para TB testes de resistência poderiam fornecer novas informações valiosas para os médicos em relação ao valor tradicional concentração crítica, especialmente para aqueles isolados com susceptibilidade "borderline".

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Placas de microtitulação AST e selo adesivo	TREK Diagnostics, Cleveland Ohio	MYCOTB
Padrão de McFarland 0,5	TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio	E1041
Middlebrook 7H10 placas	Pescador
Agar Plates sangue	Pescador
Estéril loops 1 mL	Pescador
Loops estéril 10 L	Pescador
Sensititre Saline-Tween caldo de contas de vidro	TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio	27143
7H9 OADC Caldo	TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio	T3440
Dicas longo Pipetar	Pescador
Cochos estéril	TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio
M. tuberculosis	ATCC	27294
Pipeters: 1000, 200, 20μL	Pescador
Dicas de 1000, 20, 20 mL	Pescador
Pipeta multicanal	Pescador
Incubadora de CO% 05-10 fevereiro	Pescador
Sacos de plástico, pequena, CO 2 permeáveis	Poly Plásticos, Delano, PA
Desinfetante TB (Tais como ProSpray C-60)	Certol International, Commerce City, CO	PSC60/32
Box espelho Leitor	Pescador