Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

Resumo

Apesar dos avanços recentes na modificação genética, transfecção de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) continua a ser um processo caprichoso. Para nosso conhecimento, métodos sistemáticos e eficiente para transfectar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) não foram relatados. Aqui, descrevemos protocolos robustos de forma eficiente e transfectar nucleofect iPSCs humanos.

Resumo

A modificação genética continua a ser uma ferramenta essencial para o estudo da biologia de células-tronco e em estabelecer potenciais aplicações clínicas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) ^1. Embora melhoramentos nos métodos de entrega de vários genes foram descritos ^2-9, a transfecção continua a ser um processo caprichoso para hESCs, e ainda não foi relatado em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Neste vídeo, é mostrado como o nosso laboratório de rotina e transfects nucleofects iPSCs humanos utilizando plasmídeo com um verde fluorescente melhorada proteína repórter (eGFP). IPSCs humanos estão adaptados e mantidos como alimentador de culturas isentas de eliminar a possibilidade de a transfecção de células de alimentação e para permitir a selecção eficiente de clones estáveis ​​transgénicas iPSC após a transfecção. Para nucleofection, iPSCs humanos são pré-tratados com inibidor ROCHA ^11, tripsinizadas em pequenos aglomerados de células, e novamente plaqueadas em nucleofected alimentadores de alimentador de células condicionadomeio para melhorar a recuperação de células. Transgene-expressam iPSCs humanos pode ser obtida depois de 6 horas. Selecção antibiótico é aplicado após 24 horas e estáveis ​​linhas transgénicas aparecer dentro de 1 semana. Nosso protocolo é robusto e reprodutível para linhagens iPSC sem alterar pluripotência destas células.

Protocolo

Nosso protocolo começa com um método para se adaptar iPSCs humanos a culturas alimentador livres, seguida de protocolos para a transfecção de iPSCs humanos usando GeneJuice (EMD) e nucleofection de iPSCs humanos usando um dispositivo AMAXA nuclefector.

Nota: Os seguintes procedimentos são realizados numa chaminé de fluxo laminar estéril. Todos os meios e soluções são equilibradas a 37 ° C ou à temperatura ambiente antes de iniciar a menos que especificado de outra forma.

1. Estabelecer iPSCs humanos no alimentador-livres

IPSCs humanos previamente mantidos em células alimentadoras podem ser divididos e transferidos para Geltrex revestido prato e mantida por duas passagens antes do alimentador sem transfecção.

1. Descongelar Geltrex durante a noite a 4 ° C. Para preparar o revestimento Geltrex, diluir descongelado Geltrex 1:50 em DMEM frio. Misturar as soluções suavemente.

Nota: Geltrex, como Matrigel é uma forma solúvel de MATR membrana basalix purificadas a partir de murino Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células tumorais. Alternativamente, Matrigel pode ser usado como uma matriz extracelular de estabelecer alimentador sem culturas humanas IPSC.

2. Cobrir a totalidade da superfície dos poços de cultura com Geltrex solução (1 ml para um poço de 35 mm). Casaco poços com Geltrex a 37 ° C durante 1 hora incubadora.
3. Para iPSCs passagem humanos, adicionar 1 ml de Accutase por poço e incubando a 37 ° C durante 1 min, até a maioria das células começam a separar.

Para iPSCs passagem humanos, adicionar 1 ml de Accutase por poço e incubando a 37 ° C durante 1 min, até a maioria das células começam a separar.

4. Adicionar 10-15 pérolas de vidro para as células e agitar suavemente a placa. Adicionar 2 ml de DMEM KnockOut / F12 e triturar suavemente. Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 10 ml.
5. Girar as células a 800 rpm durante 3 minutos à temperatura ambiente.
6. Aspirar o sobrenadante dos tubos, deixando humano iPSC pellet intacto. Agite suavemente o tubo paradispersar pellet celular.
7. Remover Geltrex do poço revestido.
8. Gentilmente ressuspender o pellet em iPSC humano num volume apropriado de STEMPRO. Distribuir entre os poços de alimentadores, dependendo da taxa de proliferação celular). IPSCs humanos podem ser passadas em uma razão de divisão de 1:2 a 1:6.
9. Cuidadosamente lugar em 5% CO ₂ incubadora, redemoinho a placa cuidadosamente para assegurar uma distribuição uniforme de células em poços.
10. Células de alimentação diários até que as células estão prontas para ser dividido de novo (quando as células atingem a confluência de 80%).
11. IPSCs passagem em humanos bem novo Geltrex revestido (passo 1,3-1,9) em uma razão de divisão de 1:2. Colónias pequenas devem ser formados e distribuídos uniformemente sobre Geltrex revestido bem antes da transfecção.

2. A transfecção de iPSCs humanos com GeneJuice

As células (cultivadas em placas de 6 poços), devem ser, aproximadamente, 40 a 50% confluentes no dia da transfecção para atingir a eficiência de transfecção óptima. Énão é necessário mudar o meio da célula até ao dia seguinte.

1. Preparar 100 uL KO-DMEM/F12 em 1,5 ml de um tubo eppendorf estéril. Adicionar 27 ul de reagente de transfecção GeneJuice. Misturar bem. Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos.
2. Adicionar 4 ug de ADN do plasmídeo. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 15 minutos. A escolha do plasmídeo é crítico para a eficiência de transfecção óptima. Usamos um plasmídeo com uma proteína de fluorescência verde melhorada (eGFP) conduzido por promotor CAG ⁵ (pCAG-eGFP). CAG promotor é um promotor forte que é transcripcionalmente activo em iPSCs humanos e, assim, pode ser utilizado para dirigir a expressão do transgene em tais células. Em nossas mãos, linearização de plasmídeo não parecem afetar a eficiência de transfecção.
3. Adicionar GeneJuice DNA-mistura para as células e redemoinho da placa. Girar a placa a 1200 rpm durante 5 minutos (método de 'spinoculation'), para aumentar o contacto da mistura de transfecção com iPSCs humanas sobre o poço.
4. Incubar as células a 37 ° C durante a noite.
5. Monitorar a eficácia de transfecção, no dia seguinte.
6. Para transfecção estável, alterar médio no dia seguinte com STEMPRO fresco. Adicionar selecção antibiótica apropriada após 24 - 48 horas.

3. Nucleofection de iPSCs humanos

IPSCs humanos cultivados em alimentadores ou Geltrex pode ser usado para nucleofection. No entanto, recomendamos repique nucleofected iPSCs humanos para os fibroblastos embrionário (MEF) ou fibroblastos prepúcio humano (HFF) alimentadores para garantir a viabilidade das células de alta e recuperação. Pelo menos 2 milhões de células deve ser utilizado para alcançar a sobrevivência celular após mais nucleofection.

1. Prepare alimentador de células-meio condicionado (MC), incubando KnockOut iPSC soro humano de reposição (KOSR) meio com células alimentadoras durante a noite. Colete CM a cada 24 horas.

Nota: Qualquer estirpe de ratinho utilizada para a preparação de camadas alimentadoras (como BLK6, CF1 e MF1) é adequado para ser usado for tornando CM.

2. No dia da nucleofection, pré-tratamento de humanos com 10 iPSCs inibidor ROCHA uM durante pelo menos 1 hora.
3. Preparar 82 ul de solução de Nucleofector humano de células estaminais em 1,5 ml de um tubo eppendorf estéril. Adicionar 18 ul de complemento 1. Misturar bem. Incubar solução a 37 ° C durante 5 mins.
4. Pré-aquecimento alimentador célula-condicionado meios de comunicação (CM) e 0,25% de tripsina / EDTA a 37 ° C. Sob o capô, prelabel um tubo estéril 15 ml.
5. Remova cuidadosamente a mídia da cultura iPSC humano a ser nucleofected. Lavar suavemente as células com 2 ml de solução de fosfato de 1X tampão (PBS) por poço. Aspirar o PBS. Adicionar 1 ml de tripsina a 0,25% por poço. Incube as células a 37 ° C durante 3 minutos.
6. Triturar suavemente as células com 1000 ml ponta da pipeta. Lava-se a parte inferior do poço, para garantir que todas iPSCs humanos são completamente separadas. Transferir a suspensão de células do tubo rotulado 15 ml cónico.

Nota: tripsinização em c únicoells deve ser estritamente evitada. As células devem apenas ser desalojada em pequenos aglomerados de células consistiu em aproximadamente tripletos de células. Pequenos aglomerados de células (células triplos) será dissociado em células individuais durante o manuseamento subsequente das células.

7. Adicionar 9 ml de mídia do MEF para inativar a tripsina. Girar as células a 800 rpm durante 3 minutos. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e deixar o sedimento de células intactas.
8. Ressuspender as células em 100 uL de solução pré-aquecida de células estaminais humanas Nucleofector do Passo 3.3.
9. Transferir as células para uma cuvete de Nucleofector utilizando uma ponta de pipeta de 1 ml.
10. Adicionar 4 ug de DNA do plasmídeo para a suspensão de células na cuvete. Misture células e de DNA por movimentos lentos. Toque a cuvete duas vezes sobre a superfície capuz.
11. Coloque a célula no suporte Nucleofector. Usar programas B-016. Células Nucleofect pressionando o botão X.

< > Será exibida quando o processo nucleofection é completed (normalmente leva apenas 1-5 segundos). O uso de outros programas nucleofection (A-023, A-033 e U-023) produziram menos de 10% de células positivas para eGFP de iPSCs humanos.

12. Recuperar células da cuvete nucleofected usando a pipeta de Pasteur de plástico fornecido. Recuperar células por ressuspensão em CM pré-aquecido e inibidor de rocha em 1,5 ml estéril tubo eppendorf. Incube as células a 37 ° C durante 10 minutos para permitir que as células recuperam.
13. Células de transferência de gota a gota, em camadas de alimentação com 1 ml ponteira. Incubar as células a 37 ° C durante a noite.
14. Monitorar a eficácia de transfecção, no dia seguinte. Para obter clones estáveis ​​de transgênicos iPSCs humanos que expressam estavelmente transgene, mudar médio no dia seguinte com CM e inibidor ROCK. Adicionar selecção antibiótica apropriada após 24 - 48 horas.

4. Resultados representativos:

Figura 1. Fotomicrografias de Riv1 iPSCs humanas transfectadas com pCAG-eGFP. (A) expressam eGFP Riv1 células transfectadas utilizando GeneJuice Geltrex em 12 horas pós-transf ecção. As colónias de Riv1 iPSCs humanos plaqueadas e formado em alimentadores seguintes nucleofection usando B-016 (B) e A-023 (C) do programa. (D) de forma estável que expressam eGFP-humanos colónias iPSC com expressão ubíqua eGFP derivado GeneJuice. (E) estavelmente transfectadas Riv1 iPSCs humanos retido expressão constitutiva eGFP durante a diferenciação do corpo embryoid.

Discussão

Nosso resultado de protocolos de técnicas simples, robusto e altamente reprodutível para introduzir transgenes em iPSCs humanos sem efeitos tóxicos proeminente e morte celular. IPSCs humanos devem ser passadas em pedaços mais pequenos de células (células de 5-10) e plaqueadas em placas de Geltrex em alta densidade (1:2), para assegurar a eficiência de transfecção óptima em numerosas pequenas colónias. Para linhagens de iPSC que são mais propensos a diferenciação e morte celular, maior o número de iPSCs humanos (até 4 X 10 ⁶ células) deve ser usada para uma experiência única nucleofection. Ensaio de transfecção transiente gera um grande número de transgenes que expressam iPSCs humanos dentro de 1 dia. Estavelmente transfectadas clones iPSC geralmente aparecem dentro de 7 dias, e essas colônias transgênicas deve estar pronto para ser escolhido dentro de três semanas. O uso de promotor CAG descrito aqui garante expressão ubíqua de repórter EGFP. Sob tais melhorias, nossos protocolos pode ser alimentado em outras aplicações, incluindo a superexpressão, cindução onditional, derivação de linhas de linhagem específica repórter, shRNA ou siRNA knockdown, a recombinação homóloga do gene alvo e.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
0,25% de tripsina com EDTA	Invitrogen	25200056
2-mercaptoetanol	Invitrogen	21985-023
3 milímetros pérolas de vidro	Fisher Scientific	11-312A	Pérolas de vidro devem ser lavados com ácido clorídrico (HCl) durante a noite, lavada com hidróxido de sódio (NaOH) e água destilada, e esterilizadas por autoclavagem antes da utilização.
Célula Accutase reagente dissociação	Invitrogen	A11105-01
Factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF)	Invitrogen	PHG0263
DMEM (glucose elevada)	Lonza	12-741 F
Soro fetal de vitela	Invitrogen	16000044
Geltrex	Invitrogen	12760013	Fator de crescimento reduzido
GeneJuice reagente de transfecção	EMD Biosciences	70967
Glutamax-I (100X)	Invitrogen	35050061	L-glutamina (Invitrogen, 25030081) também podem ser usados ​​em seu lugar.
Humana iPSC KOSR mídia			500 ml humano media ES consiste em 390 ml de DMEM KnockOut / F12, 100 ml de soro KnockOut Replacer, 5ml Glutamax-I (100X), NEAA 5ml (100X), 500 ul de 2-mercaptoetanol (55 mm) e suplementado com 10 ng / ml bFGF .
KnockOut DMEM/F12	Invitrogen	12660-012
Substituição KnockOut Soro (KOSR)	Invitrogen	10828-028
Rato mídia fibroblastos embrionárias			MEF mídia consiste em 90% de FBS, NEAA 1X, 1X Glutamax-I e 1X piruvato de sódio, em meio DMEM (glucose elevada)
Aminoácido não essencial, NEAA? (100X)	Invitrogen	11140050
Células estaminais humanas solução Nucleofector um com suplemento	Lonza	VAPH-5012
Solução salina tamponada com fosfato sem Ca 2 + e Mg 2 +	Invitrogen	10010023
Piruvato de sódio (100X)	Invitrogen	11360070
STEMPRO meio kit	Invitrogen	A1000701	500 ml STEMPRO mídia consiste em 454 ml de KnockFora DMEM / F12, 10 ml STEMPRO suplemento de crescimento isento de soro (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml de BSA (albumina de soro bovino, 25%), 909 ul de 2-mercaptoetanol (55mm ) e suplementado com 10 ng / ml de bFGF.