Fechamento do tubo neural no embrião do rato Cultura Whole

Resumo

Um método que permite a manipulação farmacológica direta de embriões de camundongos durante a neurulação que ultrapassa o metabolismo materno é descrito. A técnica pode ser adaptada para estudar os diferentes aspectos da neurulação, variando o ponto de tempo e agente farmacológico.

Resumo

Modelos de ratos genéticas são uma importante ferramenta no estudo de fechamento do tubo neural de mamíferos (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). No entanto, o estudo dos embriões de camundongos in utero é limitado pela nossa incapacidade de manipular diretamente farmacologicamente os embriões no isolamento dos efeitos do metabolismo materno sobre o reagente de interesse. Seja usando uma pequena molécula, a proteína recombinante, ou siRNA, a entrega dessas substâncias para a mãe, através da dieta ou por injecção sujeitará estes compostos instáveis ​​a uma variedade de defesas corporais que poderiam impedi-los de alcançar o embrião. Investigações em culturas de todo o embrião pode ser usado para separar materna intrínseca de efeitos sobre o desenvolvimento fetal.

Aqui, apresentamos um método para cultivo de embriões de rato usando a mídia altamente enriquecido em um aparelho de incubadora de rolos que permite o fechamento do tubo neural normal, após a dissecção (Crockett, 1990). Uma vez que na cultura, os embriões podemser manipulados usando técnicas in vitro convencional que não seria possível se os embriões ainda estavam no útero. Irmãos embrião pode ser coletadas em vários pontos do tempo para estudar os diferentes aspectos da neurulação, ocorrendo a partir E7-7.5 (formação de placa neural, pouco antes do início da neurulação) para E9.5-10 (na conclusão do neuroporo dobrar e caudal do crânio fechamento, Kaufman, 1992). Neste protocolo, demonstramos o nosso método para a destruição de embriões em intervalo de tempo que são ideais para o estudo da neurulação craniana. Os embriões serão dissecados em E8.5 (aprox. 10-12 somities), após o início do fechamento do tubo neural, mas antes de ligar embrião e fechamento neural cranial fold, e mantidos em cultura até E10 (26-28 somities), quando cranial neurulação deve ser completa.

Protocolo

1. Preparação de meios de cultura - todos os reagentes estão listados na Tabela 1

1. Thaw soro de ratos machos a 37 ° C.
2. Heat-Inativar soro de ratos por 30 minutos a 55 ° C
3. Soro dos ratos, no 10K centrífuga por 5 minutos em temperatura ambiente
4. Remover 50:50 sobrenadante e misture com fenol vermelho-livre DMEM w / glicose alta
5. Esterilizar os meios de comunicação utilizando um filtro de seringa de 0,45 hm
6. Pelo menos 1 ml de media / embrião deve ser preparado

2. Isolamento do útero da mãe grávida

1. Usando procedimentos aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê de Uso (IACUC), a barragem é a primeira grávida anestesiados e sacrificados por deslocamento cervical
2. Esterilizar o abdômen com EtOH 70%
3. Aperte um pequeno caminho de pele ao longo da linha média, pouco acima da linha dos mamilos, com uma pinça grande e abrir o abdômen debaixo de seu fórceps com uma tesoura grande. Tenha cuidado para não danificar nenhuma estrutura internas
4. Use a tesoura para cortar lateralmente a partir da abertura inicial para cada lado do mouse para que todo o abdômen está aberto
5. Intestinos e excesso de bolsas de gordura pode muitas vezes obscuros no útero e essas devem ser movidas de lado para que a parte superior do útero e ovários pode ser observado em cada lado
6. Aperte a parte superior do útero abaixo os ovários e use a tesoura para separar o útero a partir da gordura, o corte de uma extremidade do útero ao ovário outros
7. Retire do útero com o forceps e colocar em uma placa de Petri com solução salina

3. Remoção dos embriões do útero

1. Lavar o útero com solução salina para remover qualquer excesso de sangue e aparar o excesso de gordura do lado de fora
2. Transferir para um prato limpo, com temperatura ambiente. Tyrodes salina para melhorar a visualização
3. Usando um microscópio estereoscópico, separe cada embrião usando uma tesoura pequena multa ou se necessário (# 5) fórceps cuidadosamente casca do útero distante.
4. Inserir uma pinça fina para o espaço entre a parede uterina ea decídua e descole da parede uterina, tomando cuidado para não furar o embrião

4. Remoção de decídua de embriões

1. Orientar o decidua de modo que a parte mais escura (placenta) está voltado para longe de você
2. Faça uma incisão com o fórceps ao longo da linha que separa a parte escura do decidua do isqueiro parte, tomando cuidado para não cortar demasiado profundamente
3. Completar a separação da placenta da parte superior do saco vitelino, tomando cuidado para não rasgar o cone ectoplacental (EPC). Neste ponto, você deve ser capaz de visualizar a membrana Reicherts no saco vitelino
4. Continue para remover o decidua inteiro (mais leve porção) tomando cuidado para não furar o saco vitelino
5. Aperte suavemente e remover o Reicherts por raspagem-lo longe do EPC. Se o EPC está danificado ou separado do saco vitelino, embriões vai deixar de vez normalmente a partir E8.5-E9.5
6. Com o Reicherts removida do embrião deve ser facilmente visível através do saco vitelino e pode ser encenado por somities contagem.

5. Configurando o sistema de cultura

1. Cortar o final de uma pipeta de plástico com uma tesoura para aumentar o diâmetro da abertura para que um embrião pode ser pipetado sem danificar o saco vitelino
2. Encher garrafas roller limpo com 1 ml de mídia por embrião. Dependendo do tipo de garrafas de rolo usado um máximo de 3-6 embriões podem ser colocados em cada garrafa.
3. Transferência de embriões utilizando a pipeta cortada para a garrafa cheia de rolos de mídia, transportando mais como Tyrodes mínimo possível de modo a não diluir a mídia
4. Anexar a ficha de borracha (bung) para a parte superior da garrafa de vidro rolo
5. Inserir as garrafas roller no tambor cultura rolo de modo que uma boa vedação é formada entre o plug eo tambor
6. Uma vez que todas as garrafas foram anexados, e quaisquer espaços vazios no tambor foram selados wrolhas de borracha ith, ative o rolo
7. Abra CO ₂ e O ₂ tanques e ajustá-los a cerca de 2 psi, de modo que a válvula de saída está lançando uma bolha por segundo. Para E8.5-E10 embriões, 20% O ₂ e 5% CO ₂ deve ser usado.
8. Garantir que a incubadora está definida para 37 ° C e cobrir ou fechar a incubadora para que os embriões são protegidos da luz.
9. Embriões devem ser verificados periodicamente para avaliar o seu desenvolvimento através da adição de somities, a progressão de transformar, e na medida de fechamento do tubo neural
10. Depois de 2-3 horas de cultura, inibidores farmacológicos ou outros tratamentos podem ser adicionados aos meios de comunicação
11. O desenho do estudo deve incluir controles, como veículo ou análogos inativos do reagente de estudo.

6. Avaliação do desenvolvimento após a cultura de embriões todo

1. Desligue o gás, pare de rolo, e remover as garrafas de incubadora
2. Embriões transferir de volta para Tyrodes ou PBS em uma placa de Petri para avaliação sob estereomicroscópio
3. O saco vitelino deve aparecer balão-como, num piscar de olhos devem ser visíveis e freqüência cardíaca deve ser> 120 batimentos por minuto, ea circulação deve ser evidente
4. Embriões fotografia antes de yolk sac remoção, se necessário
5. Remover saco vitelino do embrião, cortando um buraco perto da EPC e lançando o saco vitelino e âmnio sobre a cabeça e garupa do embrião.
6. O cordão umbilical pode ser cortado para separar o saco vitelino do embrião e do saco vitelino pode ser usado para genotipagem do embrião, se necessário.
7. Examine o embrião para o número de somito e defeitos do tubo neural, tais como dobras abertas cranial, fechamento incompleto da face e / ou um neuroporo aberta caudal. Embriões podem ser estadiados segundo a classificação de alterações Theiler morfogenética múltipla ( http://www.emouseatlas.org/ emap / home.html ) Mais uma vez, um registro fotográfico dedesenvolvimento embrionário é útil.

7. Notas

1. A dissecção de alta qualidade é essencial, porque qualquer nick ou lágrimas no saco vitelino impedirá virando sucesso e inibir o desenvolvimento normal. O EPC também podem ser danificados durante a remoção da membrana de Reichert (RM), e se o EPC é ainda parcialmente separado do saco vitelino, os embriões não se desenvolverá normalmente. No entanto, a remoção incompleta da RM pode causar embriões para ficar juntos e / ou células RM podem overgrow na cultura e na gema de constrição expansão saco, sendo que ambos vão impedir o desenvolvimento normal.
2. Pinças limpas e nítidas são o segredo para obter uma dissecção bom, porque fórceps maçante ou dobradas tornar o processo muito mais difícil. Depósitos de proteínas em instrumentos vai levar a danos nos tecidos.
3. Limpa, garrafas de vidro estéreis também são essenciais para evitar que embriões de degola para a parede lateral e sendo danificado. Antes de iniciar o experimento, as garrafas devem ser scrubbed com água e sabão, enxaguados em dH ₂ O, e microondas com uma pequena quantidade de água em cada garrafa até que a água ferve. Garrafas são então lavados com EtOH 70% e permitiu secar ao ar.
4. Trabalho o mais rápido possível, porque quanto mais cedo o embrião pode ser transferida para os meios de cultura e aquecido de volta para 37 ° C a sobrevivência do melhor.
5. Completa dissecar toda a ninhada antes de transferir qualquer embriões para garrafas de rolos de modo que cada embrião é a temperatura ambiente para a mesma quantidade de tempo para evitar a criação de alguma discrepância no crescimento do embrião
6. Manter um ambiente estéril para evitar contaminação bacteriana das culturas. Experimentos nossa cultura ter sido realizada sem antibióticos, mas muitos laboratórios adicionar antibióticos para seus meios de comunicação para prevenir o crescimento bacteriano. O meio deve aparecer como clara no final do experimento como era no início do experimento. Se a mídia tornou-se nublado ou há um precipitado visível, provavelmente haverá um concontaminação que infectou sua cultura.
7. Troca gasosa ineficaz também pode retardar o desenvolvimento de embriões, por isso não deixe de ter um regulador de confiança que vai garantir a entrega contínua.
8. Embriões se desenvolvem cerca de 50% mais lento em cultura ex vivo, portanto, é essencial contar somitos para garantir que você tenha atingido o estágio adequado de desenvolvimento para a conclusão do experimento.

8. Resultados representativos:

O aparecimento de embriões pré e pós-roller-cultura é ilustrada na Figura 1. No momento da dissecção, os embriões devem estar em uma configuração unturned (Fig. 1A, D) onde a cauda está por trás das dobras cabeça. Após 36 horas de cultura, os embriões deverão ter concluído o giro de modo que eles estão no C-curva, posição fetal, onde a cauda está na frente da cabeça (Fig 1B, C, E, F). Manipulação farmacológica com inibidores da quinase RhoA (Y-27632), um conhecido inibidor da extensão convergente duranteneurulação (Ybot-Gonzalez, 2007), resulta em um encurtamento dos embriões ao longo de seu eixo rostral-caudal (Fig. 1E, F) e inibe o fechamento do crânio neural dobra. Nossos dados mostram que doses crescentes de Y-27632 progressivamente prejudica fechamento vezes cranial (Figura 2A) e encurta o eixo do corpo (Fig. 2B), de acordo com o papel de downstream RhoA sinalização em neurulação cranial e extensão convergente.

Figura 1. Aspecto de culturas e manipulação de embriões com o inibidor farmacológico Y-27632. (A D) embriões dissecado em E8.5 antes da cultura de embriões todo (B, E) em embriões E10 com o saco vitelino ainda intacto, após a 36hrs da cultura russa. (C, F) O saco vitelino foi removido para ilustrar virando sucesso e fechamento do tubo neural. Embriões que foram tratadas com o inibidor da quinase Rho Y-27632 (E, F) não se submeter a extensão convergente adequada e ilustramum eixo do corpo encurtado.

Figura 2. Efeito do inibidor da quinase RhoA no fechamento do tubo neural craniana e alongamento do eixo. (A) A porcentagem de embriões que foram capazes de fechar com sucesso as suas dobras cranial (NTC% = percentagem fechamento do tubo neural) é comparada com a dose de Y-27632 adicionado ao meio de cultura. (B) A distância entre a vesícula ótica e forelimb foi significativamente reduzida em doses crescentes de Y-27632 (p <0,05).

Discussão

A capacidade de separar materna, fatores intra-uterinos daqueles que são intrínsecos ao embrião durante o seu desenvolvimento é uma importante ferramenta para o estudo de todas as fases da embriogênese. Aqui analisamos os efeitos de uma pequena molécula de inibidor da quinase do utero RhoA cranial neurulação ex, eliminando assim a variável do metabolismo materno da droga. Esta manipulação farmacológica tem um efeito profundo sobre neurulação cranial e extensão convergente. Sensibilidade a este composto pode ser comparado entre os diferentes mutantes rato genético. O método aqui apresentado também pode ser aplicado em estudos de outras vias moleculares em desenvolvimento, permitindo a manipulação direta da função celular em embriões utilizando uma variedade de reagentes.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Estereomicroscópio para Dissecção	Leica	M165
Incubadora de precisão	BTC Engenharia (Reino Unido)	BTC 001
Unidade de Cultura rotativa Bottle	BTC	BTC 003
Garrafas de vidro para Rotating Unidade	BTC	BTC 005
Bung de borracha de silicone	BTC	BTC 007
Silicone Cork Rubber	BTC	BTC 008
Gás Bubbler Inlet	BTC	BTC 012
Armadilha de entrada de gás Bubbler	BTC	BTC 013
Saída de gás Bubbler	BTC	BTC 014
Cilindro de gás	TechAir		20% O 2, 5% CO 2
Regulador de gás	TechAir
Serum Rat masculino	Harlan Labs	4520
DMEM vermelho w / o de fenol	Invitrogen	31053
Seringa de 10 ml	BD	309604
Filtro de seringa	Nalgene	190-2545
Tesoura grande Dissecando (ponta Blunt)	VWR	82027-594
Extra Fine Bonn Tesoura	Multa Ferramentas Científica (FST)	14084-08
Dumot # 5 forceps	FST	11252-50
Tyrode de Saline			Conforme descrito na Cockroft 1990
10 centímetros prato de Petri descartáveis	BD	351029