Uma análise quantitativa para expressar Insulin-formadoras de colônias Progenitores

Resumo

A tridimensionais ensaio clonogênica que permite pancreático-como progenitores de se diferenciar em insulina expressar colônias é descrito. Este método tira vantagem de semi-sólido mídia contendo fatores Matrigel metilcelulose, e crescimento, no qual progenitores única proliferam e se diferenciam In vitro, Permitindo a quantificação do número de células progenitoras funcional em uma população.

Resumo

O campo de pâncreas-tronco e biologia de células progenitoras tem sido dificultada pela falta de testes funcionais in vitro e quantitativas que permitem a análise da única célula. Análises de progenitores único são de importância crítica, porque eles fornecem maneiras definitivo para inequivocamente demonstrar o potencial da linhagem de células progenitoras individual. Embora os métodos tenham sido desenvolvidos para gerar "pancreatospheres" na cultura da suspensão a partir de células individuais, várias limitações existem. Primeiro, é demorado para executar a deposição única célula para um grande número de células, que por sua vez nos comandos de grandes volumes de meios de cultura e espaço. Numeração, segundo a pancreatospheres resultante é de trabalho intensivo, especialmente quando a freqüência dos progenitores pancreatosphere de iniciação é baixa. Terceiro, o ensaio pancreatosphere não é um método eficiente para permitir que tanto a proliferação e diferenciação de células progenitoras do pâncreas na mesma cultura bem, rerestringindo a utilidade do ensaio.

Para superar essas limitações, um semi-sólido media ensaio baseado colônia de células progenitoras do pâncreas foi desenvolvido e é apresentado neste relatório. Este método tira vantagem de um conceito existente a partir do ensaio de colônias hematopoiéticas, em que a metilcelulose é usado para fornecer a viscosidade à mídia, permitindo que as células progenitoras para permanecer no espaço tridimensional como se submetem a proliferação, bem como a diferenciação. Para enriquecer insulina expressar formadoras de colônias progenitores de uma população heterogênea, utilizamos as células que expressam neurogenin (NGN) 3, um de pâncreas endócrino marcador de células progenitoras. Tronco embrionárias murinas (ES) de células derivadas de células que expressam Ngn3 marcado com o repórter da proteína verde fluorescente melhorada foram classificados e até 25.000 células por poço foram plaqueadas em anexo baixa pratos de 24 poços cultura. Cada poço continha 500 mL de meio semi-sólido com os seguintes componentes principais: conhecihylcellulose, Matrigel, nicotinamida, EXENDIN-4, ativina βB e mídia condicionado coletados de murino ES derivadas de células-pancreáticas células semelhantes. Depois de 8 a 12 dias de cultura, expressando-insulina colônias com morfologia distinta foram formadas e poderia ser ainda analisados ​​para a expressão de genes de pâncreas utilizando RT-PCR quantitativo e coloração immunoflourescent para determinar a composição linhagem de cada colônia.

Em resumo, o nosso ensaio colônia permite fácil detecção e quantificação de células progenitoras funcional dentro de uma população heterogênea de células. Além disso, o semi-sólido formato de mídia permite a apresentação uniforme dos componentes da matriz extracelular e fatores de crescimento para as células, permitindo que os progenitores a proliferar e se diferenciar in vitro. Este ensaio colônia oferece oportunidades únicas para estudos sobre os mecanismos de células progenitoras pancreático ao nível única célula.

Protocolo

1. Diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos para pancreática-like células in vitro para gerar mídia condicionado (CM) para o ensaio colônia

Procedimentos para manutenção murino ES celular, corpo embrióides formação (EB) na cultura da suspensão, e cultura de fixação para uma maior diferenciação têm sido descritas anteriormente ^03/01 e não são o foco deste relatório. A apresentação esquemática das etapas envolvidas no nosso protocolo de diferenciação é mostrado na Figura 1.

A fim de obter alta qualidade de mídia condicionado, é importante primeiro gerar seis dias de idade EBs em que pelo menos 30-40% deles estão com diâmetros de pelo menos 150 mM. O EBS maiores devem conter manchas escuras sob o microscópio de luz, sugerindo diferenciação maior (Figura 2). Seleção de alta qualidade de soro fetal bovino (FCS) é fundamental para gerar tais EBs. Lotes de alta qualidade FCS são selecionados com base na sua capacidade de apoiar o differentiation de EBs para insulina 1, glucagon e expressão do gene da amilase 2A nas fases posteriores (dia 18-20) como detectado por RT-PCR. Além disso, quando o dia-6 EBs são transferidos de cultura para cultura de suspensão de fixação (cerca de 80-100 EBs por poço em 6 pratos bem) é importante gire gentilmente as placas para reunir as EBs dia-6 para o centro dos poços. Por razões desconhecidas, manobras que aumentam a célula-célula de resultado contatos em melhor desenvolvimento de pâncreas-como células de EBs na fase posterior de fixação da cultura.

1. No dia da cultura 13, substituir a mídia anexo cultura (DMEM/F-12 (1:1), a substituição knockout 15% de soro, 2 mM L-glutamina, 50 U / mL penicilina, estreptomicina 50 mg / mL) com a cultura apego fresco media nicotinamida mM containing10, 0,1 nM EXENDIN-4 e 10 ng / mL humana recombinante activina SSB (todas as concentrações são definitivas).
2. No dia 16 de cultura, recolher os meios de comunicação a partir do passo 1.1 e filtrá-la através de um 0,2 mM poliéteresmembrana ulfone. Deste ponto em diante a mídia coletados serão conhecidos como mídia condicionado (CM). CM da alíquota em 15 mL tubos Falcon e armazená-lo a -80 ° C até pouco antes de semi-sólidos de cultura (ver Seção 3 abaixo).

2. Obtenção de pâncreas-como progenitores em suspensão única célula usando um classificador de células ativadas por fluorescência

A linha de knock-in murine ES célula, ⁴ designado como Ngn3-EGFP, onde o gene repórter EGFP substituído um alelo do locus Ngn3 foi diferenciado conforme descrito anteriormente. Ngn3 ² é um fator de transcrição básica hélice-alça-hélice (bHLH) contendo . expressas pelos progenitores pâncreas endócrino durante o desenvolvimento ⁵ dias 16 culturas foram classificadas normalmente para obter diferenciada Ngn3-EGFP ⁺ e Ngn3-EGFP ^-. células ^1,2

1. Dissociação de células diferenciadas em uma suspensão de células individuais.
   1. Incubar dia 16 culturas wiª 0,25% tripsina-EDTA (3 min, 37 ° C) para desalojar as células de poços cultura.
   2. Adicionar 10% FCS para parar a atividade de tripsina.
   3. Lavar as células com magnésio e cálcio livre de tampão fosfato (PBS) contendo 0,1% de albumina sérica bovina (BSA), centrífuga e a 300 xg por 5 min.
   4. Remover o sobrenadante e incubar os aglomerados de células com 4 mg / mL de colagenase B e U / mL 2000 desoxirribonuclease (DNase) I (30 min, 37 ° C) para produzir uma suspensão única célula. Use uma pipeta de 1000 mL de perturbar a pellets celulares a cada 10 minutos para acelerar o processo de dissociação.
   5. Lavar as células com PBS contendo BSA 0,1%, e centrifugar a 300 xg por 5 min.
   6. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em PBS contendo BSA 0,1%.
2. Preparação de células para a classificação.
   1. Adicione 2 mL DNase I (1 MU / mL) para cada suspensão de células mL para evitar reaggregation celular durante a classificação.
   2. Passe a suspensão através de uma única célula m M 40-70esh para remover agregados de grandes células.
   3. Adicionar DAPI (1 mg / mL concentração final) para a suspensão única célula.
   4. Aquisição de dados de citometria de fluxo em um classificador de celular. A MoFlo MLS classificador de células (Beckman Coulter) foi usado para este relatório.
   5. Propagação de populações de células para a classificação. Ngn3-EGFP ⁺ e Ngn3-EGFP ^- células são fechados primeiro com dispersão em frente versus dispersão lateral (Figura 3A), seguido por DAPI versus dispersão lateral (Figura 3B), largura de pulso versus dispersão lateral (Figura 3C) e, finalmente, FL1 versus auto-fluorescência (Figura 3D). O portão tipo final de Ngn3-EGFP ⁺ células é intencionalmente deslocada para a direita (Figura 3E; seta), a fim de limitar a contaminação de Ngn3-EGFP ^- células durante a classificação. Gating para controle negativo, seja dia 6 de EBs Ngn3-EGFP linha ES ou mesmo palco, dia 16 cultura de uma linha de não-transgênicas, tais como células TL1 ES (Figura 3D, painel esquerdo), pode ser usado.
3. Ordenar Ngn3-EGFP ⁺ e Ngn3-EGFP ^{- células.}

3. Células chapeamento classificados para semi-sólida cultura

1. Preparação Matrigel.
   1. Matrigel alíquota do a 1 mL por tubo e armazenar a -20 ° C antes do uso.
   2. Alíquotas congelado deve ser colocada a 4 ° C durante a noite ou em gelo durante 3 horas para descongelar um pouco antes de usar. Alíquotas descongelado deve permanecer em gelo durante semi-sólida preparação cultural para evitar resolidification.
2. Metilcelulose solução (3,3%) preparação.
   Metilcelulose pó não pode ser autoclavado. A fim de obter livre de bactérias solução de metilcelulose, use limpa barcos pesagem e bares agitar autoclavado, provetas, frascos e outros equipamentos durante o processo de preparação.
   1. Um dia antes da preparação da solução de metilcelulose, loja 200 mL de água destilada estéril dupla a 4 ° C. Além disso, preparar 500 mL de 2x DMEM/F12 media (prepare-se dissolvendo em pó DMEM / F-12 em água bidestilada), contendo 100 U / mL de penicilina eEstreptomicina 100 mg / mL e armazenar a 4 ° C.
   2. No dia da preparação de metilcelulose, adicione 500 mL de água destilada estéril dupla para um copo de vidro 1000 mL com um pedaço de papel alumínio em cima. Ferva por pelo menos 30 min para livrar a água de bolhas de ar.
   3. Coloque uma barra de agitação de grande porte (pelo menos 3 centímetros de comprimento) em um frasco de vidro 2000 mL.
   4. Medida 300 mL de água fervente e transferi-lo para o balão.
   5. Colocar o balão sobre uma placa de agitação (sem aquecimento). Lentamente, mexa a água quente para evitar a geração de bolhas de ar.
   6. Pesar 33 gramas de pó de metilcelulose e muito lentamente adicioná-lo à água quente. A água quente é necessário molhar o pó de metilcelulose de forma eficiente e ajuda a dissolução subseqüentes na temperatura fria.
   7. Continuar a agitar o pó até que a temperatura é reduzida para aproximadamente 40-45 ° C.
   8. Adicionar a 200 mL de água fria dupla destilada estéril à mistura de metilcelulose de resfriamento. Imediatamentedepois, você deve começar a ver a solução ficar transparente e viscosa, indicando que a metilcelulose é dissolvendo-se a fase aquosa. Redemoinho mão o frasco para assegurar a solução é misturado.
   9. Adicionar a 500 mL frio 2x DMEM/F12 mídia. Continue a girar à mão para misturar.
   10. Colocar o balão sobre uma chapa mexa em uma sala fria, e, lentamente, mexa a solução de metilcelulose por 24-48 horas.
   11. Alíquota da solução em 125 mL por garrafa de armazenamento e armazenar a -20 ° C. A amostra deve ser aplicada dentro de uma petridish estéril e colocados em 37 ° C incubadora para teste de esterilidade. Solução de metilcelulose descongelado pode ser mantida em geladeira por até 2 meses.
3. Preparação dos meios condicionados.
   CM degelo (ver secção 1) pouco antes de usar. Manter o CM no gelo em todo semi-sólida preparação cultura.
4. Preparar os seguintes factores de crescimento: 1,0 M nicotinamida, 0,1 mM EXENDIN-4, 10 mg / mL recombinante humana activina βB, e 10 m &u; g / mL VEGF-A. Armazenar a nicotinamida e EXENDIN-4 a -20 ° C e activina βB e VEGF-A a -80 ° C, e derretê-los imediatamente antes da utilização. Todos os meios semi-sólidos componentes da cultura deve ser mantida em gelo durante galvanização. Note-se que a adição de VEGF-A foi encontrado mais tarde não necessário para a formação da colônia. ²
5. Preparação SFB. FCS devem ser inativados pelo calor antes do uso. Incubar a FCS durante 30 minutos a 56 ° C em banho-maria para inativar proteínas do complemento. Se o frasco estoque inicial FCS mantém mais de 500 mL alíquota que em 125 mL. A maior área de superfície irá garantir um aquecimento uniforme e completa de todo o volume. Permitir que as garrafas para esfriar em temperatura ambiente por pelo menos 1 hora antes de armazenar a -20 ° C. FCS descongelado é 0,2 Hm filtrada antes de usar.
6. Misturar os componentes da cultura com células ordenadas.
   Manter as células e todos os componentes semi-sólido media no gelo durante a preparação em todos os momentos para evitar a solidificação deMatrigel. Todos os suprimentos que entram em contacto com Matrigel incluindo, pontas de pipeta, seringas e agulhas, devem ser frio. Coloque esses suprimentos a -20 ° C, pelo menos, meia hora antes de usar.
   1. Determinar a quantidade de células a ser semeados por bem em uma placa de 24 cavidades. Até 25.000 células podem ser banhado por 24 poços. Pode-se realizar uma titulação de densidade celular em experimentos iniciais para determinar o número de células ideal de semeadura.
   2. Adicionar os componentes da cultura para um tubo de poliestireno 5 mL com tampa de pressão na seqüência descrita na Tabela 1 (note que as células são adicionados nos últimos para evitar a estimulação precoce). Adicione o metilcelulose 3,3% para os tubos de poliestireno primeiro e as células classificado por último. Note-se que a solução de metilcelulose 3,3% precisa ser elaborado e acrescentou aos tubos de poliestireno com uma agulha de 16 ½ calibre e uma seringa adequadamente marcados graduado. Em geral, a fim de medir corretamente o volume de soluções viscosas, como a metilcelulose 3,3% solution ea mistura cultura final, é importante para aspirar alguma solução na seringa em primeiro lugar, e logo em seguida empurrar a solução para fora para expelir o ar. A solução de metilcelulose 3,3% pode ser aquecido à temperatura ambiente, se for muito difícil de tirar. No entanto, garantir que ele é resfriado em gelo depois que ele é dispensado dentro dos tubos de poliestireno e antes da adição de Matrigel.
7. Placa da mídia semi-sólido contendo células classificadas.
   1. Depois de assegurar as tampas dos tubos de poliestireno são firmemente no lugar, agitar os tubos por mãos vigorosamente e minuciosamente. Bolhas de ar serão gerados durante este processo.
   2. Coloque os tubos no gelo por 5 min ou até que a pequena superfície de bolhas de ar.
   3. Use uma seringa de 1ml com 16 ½ ou 18 agulhas ½ calibre para aspirar o conteúdo. Siga os conselhos 3.6.2 para desenhar o volume exato da solução viscosa sem ar em seringas.
   4. Lentamente dispensar 500 uL de mídia em cada 24 poços. Usoo anexo baixo placas de 24 poços só. Adicionar a mídia diretamente para o centro do poço. Os meios de comunicação semi-sólido automaticamente se espalhar nos poços. Para cada amostra experimental, poços quadruplicou são usados ​​rotineiramente para obter resultados estatisticamente significativos. Apenas as 4 colunas mais íntimos de uma orientados horizontalmente placa de 24 poços são usados ​​para a cultura. Preencha os poços restantes com água estéril para ajudar umidificação da cultura de células que contêm.
   5. Incubar as células em 37 ° C e 5% CO ₂ do ar.
   6. Atraso além de fatores de crescimento. É possível adicionar fatores de crescimento após o início da cultura. Esses movimentos podem ser utilizados para tratar os efeitos de sobrevivência de determinados fatores de crescimento. Soluções de fator de crescimento de até 100 mL por poço pode ser gotejado através de uma seringa de 1 mL com um G 26 08/03 agulha e permitiu de difundir na mídia semi-sólido.

4. Observar a formação de colônias sob a luz microslidar

Células devem ser observados imediatamente após o plaqueamento para garantir que as células individuais são aleatoriamente e distribuídas uniformemente fora dos poços. Se a maioria das células ou colônias resultantes são distribuídos na margem dos poços, esta indicará que a mídia dispensa semi-sólido para os poços era muito forte (ver secção 3.7.4). Devido à densidade da colônia menisco efeito nas margens dos poços cultura pode ser maior em comparação com aqueles que residem no centro.

1. Quantificação número de colônias. Devido ao recurso 3-dimensional da mídia, as colônias serão exibidos em diferentes pontos focais. Assim, um ajuste do foco de cada colônia pode ser necessária durante a observação por microscopia de luz. Anexar uma grade sob a 24 bem quando a contagem, a fim de evitar registrar mesma colônia duas vezes. A grade pode ser obtido através do corte da parede de um petridish NUNC (Cat. No.169558). Uma lente objetiva de 10x em um microscópio de luz deve ser usado para observe e contagem de colônias.

5. Resultados representativos:

Experimentos anteriores mostraram que a partir de 2,5 x 10 ⁵ células ES de camundongos R1 (em media 50 total mL) se poderia esperar para gerar cerca de 5000 tamanho adequado dia 6 EBs. As células-EGFP Ngn3 ES foram menos eficientes; 4 vezes mais células foram necessários para gerar de tamanho semelhante EBs por dia 6. Porque 25 dias-6 EBs contêm uma média de 1,88 ± 0,67 x 10 ⁵ células, ^uma cerca de 37,6 x 10 ⁶ células podem ser obtidos a partir de 5000 EBs. Durante cultura apego as células são esperados para expandir 2,72 ± 0,32 vezes. ¹ Assim, 5000 dias-6 EBs renderá aproximadamente 100 x 10 ⁶ dias 16 células antes da separação. Depois gating, as células Ngn3-EGFP ⁺ irá tornar-se aproximadamente 10% da população total do dia 16 de células (Protocolo Seção 2.2.5 Texto e Figura 3).

Exemplo do photomicrografias de insulina que expressam colônias derivadas de células ES de camundongos é mostrado na Figura 4. Estas colônias têm uma morfologia distinta; pequenas (~ 6-10 mm) colônias redonda com células individuais nas colônias, que são pequenos, escuros, e não luz refletiva. Em nossa publicação anterior, ² real-time RT-PCR e coloração de imunofluorescência dupla de colônias individualmente escolhidos a dedo revelou expressão de insulina, peptídeo C e glucagon. Estes resultados demonstram a capacidade de um único Ngn3-EGFP ⁺ células a se diferenciar em células contendo pelo menos dois hormônios das ilhotas ao mesmo tempo, assemelhando-se a primeira onda-primitivo, como células endócrinas.

O ensaio para a colônia de células dispersas único permite o estudo para os progenitores que têm a capacidade de iniciar a proliferação e diferenciação in vitro (Figura 5). Assim, este é um ensaio que pode medir a função intrínseca de células progenitoras individual. Os progenitores que têm o capabilidade de se tornar insulina expressar colônias são denominadas de insulina expressar unidades formadoras de colônia (ICFUs) (Figura 5). Consistente para a idéia de que Ngn3 marcas células progenitoras endócrinas no pâncreas em desenvolvimento, ⁵ Ngn3-EGFP ^+, mas não Ngn3-EGFP ^-. Células derivadas de células-MES populações são enriquecidos para o ICFUs ^{2 No} entanto, a freqüência desses progenitores ainda é baixo, aproximadamente 0,1% a 0,6% do total da população ⁺ Ngn3-EGFP isolado de cultura dia 16 são ^dois ICFUs Independentemente disso, uma clara diferença em formadoras de colônias de eficiência é esperado, com as células-EGFP ⁺ Ngn3 mais alto, seguido pelo. células pré-classificados, e então o Ngn3-EGFP ^- células.

Figura 1. Timeline in vitro de células-tronco embrionárias de camundongos diferenciação de células de pâncreas-like. Para condicionado media geração (CM), murinos ES cells são cultivadas em suspensão com FCS de 15% para os primeiros seis dias com doses decrescentes de monotioglicerol (6,0 x 10 ^-3 M para os dois primeiros dias e 6,0 x 10 ^-4 M para os próximos quatro dias) para gerar EBs. Dia-6 EBs (80-100 por poço) são então transferidos para fixação de 6 pratos bem contendo 15% de soro de reposição knockout. 5% FCS podem ser adicionados entre os dias 60-10 de cultura para acelerar a penhora de EBs. Nicotinamida, EXENDIN-4, e humano recombinante activina βB são então adicionados à mídia no dia da cultura 13 (ver secção 1.1). Mídia é coletada no dia 16 e cultura neste momento tornou-se mídia condicionado. Dia 16 células são então classificados e banhado em semi-sólido de mídia para ensaio de colônia.

Figura 2. Fotomicrografia Representante de grandes corpos embrióides dia-6 derivada de células-tronco embrionárias de camundongos. Ideal dias-6 EBs são pelo menos 150 M em diameter e têm centros escurecidos (setas). Expressão de marcadores de pâncreas no início progenitor (como PDX-1 e Sox9) é reforçada nestes ³ ​​EBs (dados não mostrados).

Figura 3. Sorting portas para MES derivadas de células-dia-16-Ngn3 células que expressam EGFP. (A) dispersão portas frente e lado, indicativos de tamanho de célula e granularidade, respectivamente, eliminar a não-celular detritos. (B) DAPI é usado para identificar as células mortas, que será manchada positivo quando animado com 405-413 nm e emissão detectado com um filtro 450/40. (C) de largura de pulso, a largura do pulso de dispersão eletrônica para a frente, revela doublets, que devem ser eliminados antes de ser passado através do classificador fluorescência celular ativado. (D) Gating de EGFP (canal FL1) versus autofluorescência usando dia 16 células de uma linha de células de controlo parental, como TL1 (painel esquerdo) ilumina fluorescência verdadeiro e, assim, o Ngn3-EGFP ^{população de células + (painel direito). (E) seta vermelha mostra manual de shift direita do portão EGFP + um pouco antes de triagem para aumentar a separação de células falso positivo. Eventos em ambos (D) e (E) são fechados com base nas regiões (R1 - R3) mostrado em (AC).}

Fotomicrografias Figura 4. Representante da insulina expressar colônias na semi-sólida cultura. Colônias são distribuídos aleatoriamente e aparecem como pequeno e escuro, não-aglomerados de luz reflexiva. Colônias individuais podem ser posteriormente analisados ​​para a expressão do gene e proteína por RT-PCR e análise imunohistoquímica, respectivamente (não mostrado; ver vídeo).

Figura 5. Um ensaio de colônia que permite avaliação funcional e quantitativa de células progenitoras único. Numeração das colônias resultante é utilizada para calcular a frequency das células progenitoras entre as células totais banhado. A composição de células dentro de cada colônia é um indicativo do potencial linhagem do progenitor inicial. Com este ensaio, descobrimos que Ngn3-EGFP ⁺ células derivadas de células-tronco embrionárias de camundongos foram enriquecidas de insulina que expressam unidades formadoras de colônia (ICFUs), as células progenitoras que têm a capacidade de se diferenciar em insulina expressar colônias ^2.

Tabela 1. Mídia semi-sólidas Cultura Componentes e ordem de adição.

Discussão

Ensaios de colônia que permitem avaliações quantitativas e funcionais de células progenitoras do pâncreas individuais foram limitados até agora, o que muito prejudicaram o progresso nos estudos da haste de pâncreas e da biologia de células progenitoras. A essência de um ensaio de colônia é que ele mede a capacidade intrínseca de células progenitoras, e não apenas os seus fenótipo, permitindo a funcionalidade e os potenciais de linhagem de células progenitoras que devem ser observados. É também uma ferramenta quantitativa que pode determinar o número de células progenitoras em uma dada população. No campo de células tronco hematopoiéticas, ensaios de colônia têm desempenhado um papel importante na identificação, bem como decifrar os requisitos do fator de crescimento, interações e mecanismos que regem o compromisso da linhagem dessas células. ⁶ No campo da biologia de células progenitoras do pâncreas, órgão pancreático ^{7 , 8} ou a granel culturas ^13/09 foram criadas, no entanto, tais ensaios não abordam questi biológicaons no nível da célula única. Sem análises única célula, a existência de multi-potenciais-tronco do pâncreas / progenitores não pode ser provada de forma inequívoca. ¹⁴

Aqui nós mostramos que a insulina que expressam formadoras de colônias progenitores podem ser analisadas utilizando uma imagem tridimensional, Matrigel contendo, sistema de cultivo semi-sólido. Embora um sistema de cultura de suspensão ^15,16 foi desenvolvido que permite progenitores adulto solteiro de pâncreas a proliferar e se diferenciar em "pancreatospheres", o nosso ensaio colônia oferece vantagens adicionais. Primeiro, o nosso semi-sólida cultura de sistema de mídia permite que placas de até 25.000 células classificadas por 500 mL por meio de cultura de 24 poços, mantendo a formação de colônias, resultando na faixa linear. ² Em contraste, o ensaio pancreatosphere suspensão requer o uso de um único método de deposição de células do classificador de células para permitir análises única célula, e, assim, um maior volume de meios de cultura e espaço incubadorasão necessárias. Portanto, nosso ensaio colônia é relativamente fácil e cost-effective de conduzir quando grandes números de células diferentes precisam ser comparados ao mesmo tempo para as atividades progenitor. Em segundo lugar, o nosso semi-sólida mídia permite a distribuição uniforme dos componentes da matriz extracelular e fatores de crescimento, que permite tanto a proliferação ea diferenciação de ocorrer no mesmo poço. Em contraste, é mais difícil fornecer um ambiente como esse, especialmente a matriz, para células em cultura de suspensão. Estamos conscientes de que com o nosso método não pode ser definitivamente provado que cada colônia é derivada de uma única célula, como dois progenitores podem ser posicionadas de forma aleatória próximos uns dos outros e formar uma colônia. No entanto, este problema pode ser superado pela análise secundária usando a manipulação única célula. Direta mão direita de células classificadas único poderia demonstrar definitivamente a origem única célula de cada colônia.

Em resumo, a insulina expressar formadoras de colônias de atividade progenitores em meios semi-sólidos aqui descrito oferece oportunidades únicas para estudos sobre os mecanismos de progenitores pancreático ao nível única célula. Por exemplo, em um relatório antes, descobrimos que além de Matrigel, uma mistura bruta de proteínas da matriz extracelular, na cultura da mídia é necessária para a formação da insulina expressar colônias de células-Ngn3 EGFP ^{+, 2} sugerindo a matriz extracelular é importante para aqueles progenitores. Com este ensaio colônia, agora será possível dissecar ainda mais e definir os requisitos matriz específica para tal atividade. Além de estudar progenitores derivadas de células-tronco embrionárias de camundongos, que estão atualmente investigando se esse sistema em ensaio in vitro também apóia a formação de outras colônias distintivo derivado do pâncreas e fígado de camundongos perinatal e de adultos, bem como do tecido pancreático de cadáveres humanos desprovidos de ilhotas.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material / Reagente	Companhia	Catálogo Número	Comentários
1X DMEM / F-12 (1:1)	Mediatech	15-090-CV
Soro fetal bovino	Cultura de Tecidos Biologicals	201	Consulte a Seção 1,1
L-glutamina	Gibco	25030-081
1X PBS Dulbecco	Mediatech	21-031-CV
De soro bovino Albumina	Sigma	A8412	7,5%
Matrigel	Becton Dickinson	356231	Crescimento reduzido Fator
Metilcelulose	Sinetsu Químicos, Tóquio, Japão		1.500 centipoise (High-viscosity)
Nicotinamida	Sigma	N0636
Humano Recombinante Activina βB	R & D Systems	659-AB-025
EXENDIN-4	Sigma	E7144
Humano Recombinante VEGF-A	R & D Systems	293-VE-010
Placas de 24 poços	Costar	3473	Ultra-baixo Ligação
60 milímetros Petri Dish com grade	Nunc	169558