Dissecção do coração em larval, Zebrafish Juvenil e Adulto, Danio rerio</em

Resumo

Um método, claro padronizados para dissecção e isolamento do coração zebrafish em vários estágios de desenvolvimento são descritos. Técnicas de anotação e quantificação também são discutidos.

Resumo

Peixe-zebra tornou-se um organismo modelo benéfico e prático para o estudo do desenvolvimento embrionário do coração (ver comentários recentes ^1-6), no entanto, o trabalho de examinar pós-embrionário, através do desenvolvimento adulto cardíaca tem sido limitada ^7-10. Examinar a morfologia mudança do coração amadurecimento e envelhecimento são restritas pela ausência de técnicas disponíveis para o estadiamento e isolar os corações juvenis e adultos. A fim de analisar o desenvolvimento do coração mais tempo de vida do peixe, dissecamos corações zebrafish em estágios numerosos e fotografá-los para posterior análise ^11. As características morfológicas do coração podem ser facilmente quantificadas e corações individuais podem ser posteriormente analisado por uma série de métodos standard. Zebrafish crescer a taxas variáveis ​​e maturação se correlaciona melhor com o tamanho do peixe do que a idade, assim, pós-fixação, nós comprimento dos peixes fotografia e medida como um indicador de maturação dos peixes. Este protocolo explica duas distintas, tamanho técnicas de dissecção dependente de peixe-zebra, que vão desde larvas de comprimento padrão de 3,5 mm (SL) com corações de comprimento ventrículo 100μm (VL), para adultos, com SL de 30mm e 1mm VL ou maior. Larvas de peixes e adultos têm corpo bastante distintos e morfologia do órgão. Larvas não são apenas significativamente menor, eles têm menos pigmentos e cada órgão é visualmente muito difíceis de identificar. Por este motivo, usamos técnicas de dissecção distintas.

Usamos pré-dissecção procedimentos de fixação, como descobrimos que os corações dissecados imediatamente após a eutanásia tem uma morfologia mais variável, com balão muito solto e, como átrios em comparação com os corações retirados fixação seguintes. O peixe fixadas antes dissecção, manter vivo na morfologia e posição de câmara (dados não mostrados). Além disso, para fins de demonstração, aproveitamos do coração (miocárdio) específicos GFP transgênicos Tg (myl7: GFP) ^{twu34 (12),} o que nos permite visualizar todo o coração e é particularmente útil nos primeiros estágios de desenvolvimento quando o cardíaco morfologia é menos distinta dos tecidos adjacentes. Dissecção do coração faz uma análise mais aprofundada da biologia celular e molecular subjacentes ao desenvolvimento e maturação do coração utilizando hibridização in situ, imuno-histoquímica, extração de RNA ou outros métodos de análise mais fácil no pós-embrionário zebrafish. Este protocolo irá proporcionar uma técnica valiosa para o estudo da maturação de desenvolvimento cardíacas e envelhecimento.

Protocolo

Peixe-zebra foram levantadas utilizando protocolos padrão ¹³ no Biotério Queens College a 28 ° C. Pares de peixes individuais ou acasalamentos grupo deve ser pré-formados e os embriões resultantes limpos e armazenados em um 28 ° C incubadora. Saúde dos peixes deve ser examinado diariamente. Em cinco dias pós-fertilização (DPF), o peixe deve ser separado em tanques a uma densidade de peixes 10-15 e entraram na creche facilidade de peixe. Para o protocolo aqui apresentados foram coletados em zebrafish larva por estágios adultos: 15, 30, 45, 60, 90, 180 dpf.

1. Peixe-zebra coleção assunto e fixação

1. Retire o peixe do tanque de habitat usando net e coloque em 0,2% tricaina para anestesiar.
2. Coloque os peixes anestesiados em água gelada por 15 minutos para euthanize.
3. Faça paraformaldeído a 4% fresco (PFA) em 1x tampão fosfato (PBS).
4. Incubar peixes coletados em PFA 4% por 1-2 horas à temperatura ambiente, em seguida, durante a noite a 4 ° C numa placa de Petri envolto em parafilme. Isso mantém o plano de peixe e depois faz a dissecação muito mais fácil.
5. Após a fixação, lavar duas vezes em PBS com Tween (PBT). Peixe pode ser manter em PBT, a 4 ° C por até 10 dias.

2. Medição de peixes e dissecção

1. Peixes único lugar em meia petri prato cheio de PBS fresco e colocá-lo em seu lado direito.
2. Medida de comprimento de peixes do focinho à base da cauda (o pedúnculo caudal), não incluindo aletas de cauda, ​​utilizando um paquímetro digital de milímetro (Figura 1). Este é o comprimento padrão (SL).
3. Cada peixe pode ser atribuído um número / combinação de letras para permitir que um indivíduo eo coração, resultando dissecados para ser rastreados para análise posterior. Dados, incluindo o número de ações dos pais, a idade de fixação, medições SL, foram inseridos em uma planilha e organizado com base nesses rótulos.
4. Antes da dissecação, etiqueta tiras tubo de PCR com o número de rastreamento atribuído a preencher com PBT ou outra solução apropriada para análise posterior.
5. Orient lado ventral do peixe em placa de petri, enquanto a estabilização do corpo com pinças segurando a cabeça entre os olhos e as guelras (Figura 2).

Peixes menores (menores que 12 milímetros SL):

4. a) Utilizando uma pinça afiada, ou uma micro-agulha em um suporte de pino, retire os músculos peitorais e as aletas do corpo para revelar o coração. O movimento constante do fórceps durante a dissecção pode causar correntes no PBT que movem o peixe. Isto é particularmente problemático para peixes menores, portanto, um micro-agulha pode ser usado para remover músculos peitorais e barbatanas e abrir a cavidade do corpo.
5. a) delicadamente usar a pinça para colher o coração para fora da cavidade debaixo do átrio. Alternadamente, em alguns peixes que você pode ser capaz de remover o coração puxando para fora bulboso eo resto do coração se seguirão. Tenha cuidado com a localização do átrio, se usar esta técnica, pois ele pode ser facilmente danificada. Se houver tecido extra que vem com o coração, que é fino e pode ser apagada depois.
6. a) Se o peixe contém um marcador fluorescente cardíacos, tais como Tg (myl7: GFP) ^twu34, use âmbito fluorescentes para dissecção e verificar a remoção do coração pelo florescimento (Figura 3).
7. a) Uma vez que o coração é removido da cavidade, use a pinça para segurar o coração e uma micro-agulha para remover o tecido não-cardíacas extra e do revestimento do epicárdio de fora do coração.

Peixes maiores (mais de SL 12mm):

4. b) Usando Primavera tratado micro-tesoura, faça três incisões de menos de 1mm de profundidade: 1 - corte transversal através do 2 brânquias - corte transversal no ventre anterior 3 - corte sagital no lado ventral conectando dois cortes (Figura 4).
5. b) Utilizando uma pinça afiada remove os músculos peitorais e as aletas do corpo para abrir a cavidade do corpo e revelar o tecido prateado do pericárdio (Figura 5A). Remover este tecido de pericárdio eo coração se tornará visível (Figura 5B).
6. b) Use a tesoura para cortar micro-artéria ligado ao arteriosus bulbosa, situada superior ao coração. Uma vez que esta artéria é cortada, coloque as pontas fórceps sob o átrio, use a pinça para colher o coração para fora da cavidade. Se houver tecido extra que vem com o coração, que é fino e pode ser removido mais tarde.
7. b) Uma vez que o coração é removido da cavidade, use os dois pinça para segurar o coração e remover o tecido extra, ou um par de pinças para segurar o coração e uma micro-agulha para remover extra, o tecido não-cardíacas. O forro do epicárdio, evidente pela sua pigmentação preta, pode ser retirado a partir do exterior do coração, se desejar delicadamente raspando o tecido.

3. Fotografia de corações

1. Prepare uma 23g / L de ágar nutriente placa de petri e cubra ágar solidificado com PBS.
2. Usando a pinça, faça um buraco no agar que permite que o coração para descansar na orientação desejada para fotografar.
3. Remove o coração do tubo de PCR, segurando a ponta do bulbo com a pinça com firmeza. Coloque o coração no prato agar.
4. Orientar o coração em agar para fotografar. A amostra pode ser rodado depois de cada imagem para todas as orientações possíveis (Figura 6).
5. Use o tempo de exposição de luz sobrecarga e curto para fotografar o coração. Fazer ajustes para a qualidade da luz usando a exposição necessário para obter a melhor fotografia.

4. Resultados representativos:

Um exemplo de um coração bem dissecados limpa é mostrado em orientações múltiplas na Figura 6. Cada coração vai ter algumas diferenças na morfologia geral, mas o coração deve ser completa, contendo um ventrículo intacto, átrio e arteriosus bulbosa. Alguns exemplos desta variação na morfologia geral são mostrados na Figura 7. O preto manchado tecido epicárdico também pode removido do coração.

Figura 1. Meça os peixes do focinho à pedúnculo caudal usando uma câmera digital milímetros paquímetro.

Figura 2. Segure o peixe com uma pinça entre os olhos e guelras.

A Figura 3 cardíaca marcador fluorescente específica transgênicos, como Tg (myl7: GFP). ^Twu34, mostrado aqui, pode auxiliar na visualização corações dissecados de peixes menores.

Figura 4 Três incisões para remover os músculos peitorais e da pele: 1 - corte transversal através das brânquias 2 - corte transversal no ventre anterior 3 - corte sagital no lado ventral conectando ambas as cortes..

. Figura 5 letras Black Label as câmaras do coração: arteriosus bulbosa (ba), ventrículo (v), e no átrio (a).
A-A cavidade superior do corpo está aberto para mostrar o tecido prateado do pericárdio.
B-Após a remoção do pericárdio, o coração é visível e facilmente removidos.

Figura 6. Orientações diferentes do coração são mostrados. Letras pretas rótulo as câmaras do coração: arteriosus bulbosa (ba), ventrículo (v), e no átrio (a). Setas indicam Cinzento localização e orientação do coração, em referência à sua localização normal no corpo: anterior (A), posterior (P), dorsal (D), ventral (V), esquerda (L) e direito (R). Barra de escala indica 400 micras.
A-ventral vista do coração
B-dorsal vista do coração
C-lateral vista do lado esquerdo
D-lateral vista do lado direito

Figura 7. Morfologia de corações de tamanhos diferentes é mostrada. Letras pretas rótulo as câmaras do coração: arteriosus bulbosa (ba), ventrículo (v), e no átrio (a). Barra de escala indicada 400 m.
AC-Hearts peixes formulário com menos de 12 milímetros SL
DF-Hearts peixes formulário com SL maior que 12 mm

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Discussão

Estes métodos para dissecção do coração do peixe zebra pós-embrionário de peixes permite a remoção completa de um coração danificado. Embora essa técnica é simples e fornece guias para cortes externos que irão evitar danos ao coração, uma mão firme é essencial para peixes menores.

Um passo fundamental durante a dissecção é identificar o pericárdio prateado como o coração está diretamente dentro desse saco. Visualizando o pericárdio fornece um importante marcador par...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Paraformaldeído	EMD	PX0055	.04g/mL Em PBS
Fórceps # 55	FST	11295-51
Micro-tesoura	FST	15005-08
Titular Pin	FST	26016-12
Micro-agulhas	FST	10130-10
Agar nutriente	BBL	11472	23g / L de H 2 O destilada
Placas de Petri	BD Falcon	351029
PCR 8 tubo de tiras	EUA Scientific	1402-2500
Caliper Digital	Fisher Scientific	14-648-17