Genome-wide tela de Metas de miRNA Usando a missão Biblioteca ID Alvo

Resumo

A Biblioteca de ID de destino é um plasmídeo baseado em coleta de todo o genoma de cDNA clonado usado para identificar alvos miRNA. Aqui nós demonstrar o seu uso e aplicação.

Resumo

A Biblioteca de ID Alvo é projetado para ajudar nas metas de descoberta e identificação de microRNA (miRNA). A biblioteca de ID do alvo é um plasmídeo baseado em biblioteca de todo o genoma de cDNA clonado a jusante 3'UTR a partir da proteína de fusão de selecção de dupla, timidina-quinase zeocin (TKzeo). A primeira rodada de seleção é para transformantes estáveis, seguido com a introdução de um miRNA de interesse, e, finalmente, a seleção de cDNAs contendo a meta de miRNA. CDNAs selecionados são identificados por seqüenciamento (ver Figura 1-3 Fluxo de Trabalho para a Target Biblioteca ID e detalhes).

Para garantir uma ampla cobertura do transcriptoma humano, Target ID Biblioteca cDNAs foram gerados através de oligo-dT priming usando um pool de ARN total preparado a partir de vários tecidos humanos e linhas celulares. Resultando gama de cDNA de 0,5 a 4 kb, com um tamanho médio de 1,2 kb, e foram clonados no dupla-selecção p3TKzeo plasmídeo (ver Figura 4 para o mapa do plasmídeo). Os alvos de genes representados na library podem ser encontradas no site da Sigma-Aldrich. Os resultados de sequenciação Illumina (Tabela 3), mostram que a biblioteca inclui 16.922 dos 21,518 genes únicos em UCSC RefGene (79%), ou 14.000 genes com 10 ou mais lê (66%).

Protocolo

1. Transfecção com Biblioteca alvo ID e Seleção de linhagens celulares estáveis

1. Zeocin Curva da matança

Zeocin é usado para selecionar para estavelmente células transfectadas. No entanto, zeocin excesso provoca respostas indesejadas fenotípicas na maioria dos tipos celulares. Portanto, uma análise da curva de matança devem ser realizados para determinar a dose letal mínima.

1. Placa de 1,6 x 10 ⁴ células em poços de uma placa de 96 poços em 120 uL de meios de comunicação.
2. No dia seguinte, adiciona zeocin em aumentar as concentrações que variam de 50 ug / ml a 1 mg / ml aos poços apropriados.
3. Examinar a viabilidade a cada 2 dias.
4. Substitua a mídia contendo zeocin a cada 3 dias. A concentração mínima de reagente de selecção que provoca a morte celular completa após o tempo desejado deve ser utilizado para esse tipo de célula e da experiência. Os nossos resultados mostram que 500 zeocin ug / ml é óptimo para a A549, HeLa, e células MCF7.

2.Transfection Biblioteca via Nucleofection e Seleção

1. Selecione uma linha de células que não quer expressar ou expressa baixos níveis de miRNA seu interesse. O miRNA será introduzido na Secção B para a seleção de alvos após a expressão estável da Biblioteca identificação de destino é alcançado.
2. Cultura / expandir células. Temos obtido resultados excelentes com 2 x 10 ⁷ células por transfecção biblioteca.
3. Trypsinize células que estão em> 80% de confluência, e transferir 2 x 10 ⁷ células a um 15 ml tubos estéreis de parafuso tampo.
4. Pellet tripsinizadas células a 200 xg durante 5 min.
5. Remover médio e lavar pellet celular com HBSS ou PBS 1X.
6. Centrifugar a 200 xg durante 5 min e aspirar lavagem.
7. Repita o passo de lavagem de pellet celular.
8. Pré-aquecimento 6-poços com 2 ml de meio completo a 37 ° C.
9. Adicionar 2 ug de biblioteca de destino ID (não exceder 10 uL) por 0,5 ml para cada tubo de transfecção.
10. Ressuspender as células no tubo de 15 ml de cima com 100 uL de solução Amaxa Nucleofection (célula específica) por 2 x 10 ⁶ células. Por exemplo, durante 10 Nucleofections adicionar 1 ml de reagente.
11. Uma reacção a uma hora, adicionar 100 uL de células para a ug do plasmídeo 2. Misture com uma pipeta.
12. Transfira a mistura para uma cuvete Nucleofector.
13. Inserir a cuvete instrumento Nucleofector e executar o programa otimizado apropriado para a linhagem celular (Alta Eficiência preferência sobre viabilidade celular).
14. Preencha com pipeta de transferência pré-aquecido médio. Tome-se as células em mesma pipeta e transferência para 6-bem placa. Repetir para cada Nucleofection, um por poço.
15. Retornar para câmara de crescimento para a incubação durante a noite.
16. No dia seguinte, substituir médio e permitir que as células para se recuperar durante 3-5 dias.
17. Substituir meio com meio completo contendo o nível apropriado de zeocin, como determinado a partir da análise da curva de matança.
18. Monitor células para a seleção zeocin (células de morrer).
19. Substituir meio com zeocin cada 2-3 dias.
20. Uma vez que confluentes em placas de 6 poços, a passagem da piscina, e expandir as células em frascos de maiores dimensões.
21. Período de tempo para a expansão de células é usuário e linha celular dependente, mas é altamente recomendável para expandir zeocin células resistentes para gerar crio-ações para triagem futuro (aprox. 2-3 semanas; linha celular dependente).

2. Células Biblioteca transfectar com miRNA-Expressão Construct, Selecione para linha celular estável, e selecionar alvos miRNA

Nota: A seleção Zeocin não é mais necessário ou desejado. A exposição de células a zeocin durante a expressão e selecção miRNA (meta) ganciclovir pode resultar em perda de alvos miRNA.

3. Puromicina, G418, e ganciclovir Curvas matança

1. Realize uma curva kill ganciclovir com células expressando estavelmente a Biblioteca identificação de destino e com puromicina ou G418 para o tipo selvagemcélulas.
2. Placa de 1,6 x 10 ⁴ células em poços de uma placa de 96 poços com 120 ul meios frescos. No dia seguinte, adicionar 0,1-10 ug / ml de puromycin/G418, ou 2 a 32 uM ganciclovir a poços seleccionados.
3. Examinar a viabilidade a cada 2 dias. Substitua o material contendo reagente de seleção a cada 3 dias. A concentração mínima de reagente de selecção que faz com que * morte completa da célula após o tempo desejado, deve ser utilizado para esse tipo de célula e da experiência. Os nossos resultados mostram que 0,25-1 ug / ml de puromicina é óptimo para a A549, HeLa, e células MCF7, 0,3 ug / ml de G418 para células MCF7 e 8-16 uM ganciclovir são óptimos para A549, HeLa, e células MCF7.
   
   * Nota: Com a selecção ganciclovir, o crescimento de células lenta ou não pode ser observada sem a morte celular completa. Observar células ao longo de vários dias de tratamento para verificar se eles não estão ativamente se dividindo. Se este for o caso, em seguida, vermelho de fenol no meio permanece vermelho. Também pode ser necessário realizar um kiA análise da curva ll da biblioteca ID alvo transfectadas células se uma alteração na susceptibilidade é observada. No entanto, este terá que ser determinada numa base tipo de célula específico.

4. Transfection miRNA via Nucleofection e seleção de alvos

1. Crescer / expandir as células-alvo da Biblioteca de ID para atingir 2 x 10 ⁷ células, e trypsinize quando as células estão em> 80% de confluência.
2. Transferência de 2 x 10 ⁷ células para um parafuso 15 ml estéril encimado tubo e pelete a 200 xg durante 5 minutos.
3. Remover médio e lavar pellet celular com HBSS ou PBS 1X.
4. Centrifugar a 200 xg durante 5 min e aspirar lavagem.
5. Repita o passo de lavagem de pellet celular.
6. Pré-aquecimento 6-poços com 2 ml de meio completo por poço a 37 ° C.
7. Adicionar 2 ug de plasmídeo de expressão miRNA (não exceder 10 ul) do tubo ml por 0,5 para cada transfecção. Origene plasmídeos de expressão de microRNA (neomicina - G418 de selecção) ou genes miRNA auto-clonados em pBABE-Puro (plasmídeo 1764; Addgene) têm sido utilizados com êxito. Para este último, o gancho de cabelo miRNA com ~ 200 pb em ambos os lados foi clonado a partir de PCR de DNA humano.
8. Ressuspender as células no tubo de 15 ml de cima com 100 uL de solução Amaxa Nucleofection (célula específica) por 2 x 10 ⁶ células. Por exemplo: Para 10 Nucleofections, adicionar 1 ml de reagente.
9. Uma reacção a uma hora, adicionar 100 uL de células para a ug do plasmídeo 2. Misture com uma pipeta.
10. Transfira a mistura para uma cuvete Nucleofector.
11. Inserir a cuvete instrumento Nucleofector e executar o programa otimizado apropriado para a linha de celular (de alta eficiência preferido sobre a viabilidade das células).
12. Preencha com pipeta de transferência pré-aquecido médio. Tome-se as células em mesma pipeta e transferência para 6-bem placa. Repetir para cada Nucleofection, um por poço.
13. Retornar para câmara de crescimento para a incubação durante a noite.
14. Substituir médio e permitir que as células para se recuperar durante 3-5 dias.
15. Substituir meio com meio completo contendo o nível apropriado de puromicina ou G418 como determinado a partir da curva de ensaio de matança realizada antes da transfecção com o miRNA construir.
16. Monitorar as células para puromicina / G418 seleção (células de morrer).
17. Substitua médio com dias cada puromicina / G418 2-3.
18. Uma vez que confluentes em placas de 6 poços, a passagem da piscina, e expandir as células em frascos de maiores dimensões.
19. Período de tempo para a expansão de células é usuário dependente, mas é altamente recomendável para expandir puromicina / G418 células resistentes para gerar crio-ações para triagem futuro (aprox. 2-3 semanas; linha celular dependente).
20. Substituir meio com os níveis adequados de ganciclovir (GCV) e puromicina / G418, como determinado a partir da curva de ensaio de matança realizada antes da transfecção com o miRNA construir.
21. Monitorar as células para a seleção (células morrendog, Mirna segmentação e knockdown do TK-ZEO).
22. Expandir as células na presença de GCV e puromicina / G418.
23. Preparar DNA genómico a partir das células GCV seleccionados.
24. PCR amplificar pastilhas com kit primers (ver Amplificação PCR).
25. Clone no vetor TOPOTA (Invitrogen) para o seqüenciamento padrão ou enviar produto de PCR para o seqüenciamento de profundidade.

3. PCR amplificam-selecionados Insere Biblioteca e Seqüência

Nota: Este procedimento é realizado para PCR-amplificar as metas da biblioteca que sobreviveram a seleção ganciclovir.

5. Colete ganciclovir células selecionadas para a elaboração DNA cromossômico usando um GenElute mamíferos Genomic DNA Miniprep Kit (Número de catálogo G1N10) ou equivalente. Recomendamos preparar DNA a partir da linha de células-mãe que não contém Biblioteca ID do alvo a ser usada como um controlo negativo para a comparação com o ADN a partir de células-alvo seleccionados em PCR.

1. PCR Amplify o ADN genómico com Primer Amplificação 1 e 2 Iniciador de amplificação. Amplificação bem-sucedida foi obtida com JumpStart Mix Reação REDTaq Readymix - para PCR (Código de Catálogo P0982). Optimização das condições pode ser necessário se outra polimerase é usada. Consulte a Tabela 1 para um exemplo de ajuste de PCR ea Tabela 2 para as condições de ciclismo de PCR.
2. Resolver 2-5 uL do produto de PCR num gel de agarose a 1%. O produto deve ser esperado um esfregaço com um pouco de DNA visível bandas. Compare para controlar produto de PCR de ADN genómico a partir de células sem a Biblioteca ID do alvo.
3. Prosseguir com a clonagem e / ou sequenciação de profundidade de produto de PCR. Se nenhum produto de amplificação é observado ou é idêntico para controlar DNA, optimizar as condições de amplificação por PCR (isto é, a concentração de iniciador, a temperatura de recozimento e, em ciclos).

6. Clonagem e Sequenciamento

Nota: Recomendamos a clonagem do produto da PCRS e, em seguida, realizando sequenciação padrão a partir de, pelo menos, 96 dos clones utilizando os iniciadores de amplificação fornecidos no kit. Este procedimento foi realizado com sucesso usando 96 poços durante a noite culturas e sistemas de purificação de plasmídeos. Mesmo se sequenciação profunda for desejado, os resultados preliminares de clonagem e sequenciação padrão pode ser usado como um controlo de qualidade para determinar se o custo extra de sequenciação de profundidade é garantida.

1. Seguir o protocolo de clonagem TA kit fabrico para os produtos de amplificação por PCR de clonagem (acima).
2. Transforme em clones competentes células bacterianas e selecione a noite em meio contendo antibiótico.
3. Isolar e crescer colónias individuais em cultura líquida contendo antibiótico apropriado.
4. Purifica-se DNA de plasmídeo. 6,5. Execute as reações de seqüenciamento com primers de amplificação.
5. Identificar genes alvos por um alinhamento BLAST das seqüências com transcriptoma humano (por transcrições conhecidos) e genoma humano (por tr romanceanscripts) *.

* A clonagem de resolução de problemas: Se um elevado número de insertos de sequenciação são sequência plasmídeo, optimizar as condições de clonagem / sequenciação como tal:

• Amplificação por PCR produto de qualidade (inserção) e quantidade
• Reacção de ligação
• Plasmídeo preparação (qualidade e quantidade)
• A sequenciação condições de reacção

4. Os resultados representativos

Tela Biblioteca de miR-373 alvos
Para avaliar o desempenho da Missão Biblioteca Identificação do destino, miR-373 alvos foram selecionados a partir de células MCF-7 expressando biblioteca. MCF-7 foi escolhido porque expressa pouca ou nenhuma detectável miR-373 (dados não mostrados). miR-373 foi escolhido por seu interesse biológico. miR-373 promove a expressão de invasão tumoral e metástase em MCF-7, normalmente uma linha de células não-metastático [2]. Além disso, miR-373 ortólogos do mouse miR-290 cluster estão envolvidos no rato-tronco embrionáriasmanutenção da célula [3], eo miR-373 membro da família, miR-372, promove de fibroblastos reprogramação de células-tronco pluripotentes induzidas [4]. Finalmente, foi utilizado dedo de zinco nucleases para inserir um promotor PGK-miR-373 construção de expressão no local AAVS1 em células MCF-7, e gerada uma lista de potenciais alvos miR-373 por análise de RNA microarray (dados não mostrados).

A biblioteca de ID do alvo foi transfectado em células MCF-7, e uma população de células estável foi seleccionado e amplificado em meio contendo zeocin. As células resultantes (MCF-7 Biblioteca) foram estavelmente transfectadas com uma construção de miR-373 expressando e seleccionados em meio contendo ganciclovir para enriquecer para células que expressam miR-373 alvos. Observou-se que o controlo negativo células MCF-7 Biblioteca (sem miR-373) não se soltou e tornar-se arredondada, como esperado para células mortas. No entanto, eles fez parar de crescer, que foi prontamente detectada porque o meio vermelho contendo fenol não girar amarelo-alaranjado como observado foAs células que expressam r miR-373 (Fig. 5). As células foram expandidas em meio contendo ganciclovir, e sequências alvo foram isolados por PCR com iniciadores que flanqueiam as inserções alvo identificação da biblioteca de cDNA e DNA preparados a partir das células sobreviventes. Os produtos de PCR foram Illumina sequenciado.

Como mostrado na Tabela 4, obteve-se 17.740.719 leituras de cDNA, que mapeado para 11.076 genes únicos. Destes genes únicos, 2898 foram detectados com mais de 40 leituras, e, por conseguinte, foram considerados acessos fiáveis. O vector de 13.106.469 lê eram esperados porque os iniciadores de PCR utilizados para amplificar inserções de cDNA são 40 e 300 bases para longe do local de inserção. Como tal, espera-se que as sequências mais resultantes seriam a partir do vector ao contrário mais sequenciação tradicional profunda do material genómico. Quatorze por cento não mapear para vetor ou cDNA, mas não se alinham com banco de dados NCBI não-redundante de nucleotídeos (ou seja, com sucesso NR), e apenas 1% não tinham inserção de cDNA.

Uma comparação inicial revelou que 10 dos genes únicos identificados com a biblioteca de identificação de destino são também na lista de identificados anteriormente miR-373 alvos em TarBase (Tabela 5). Estes 10 miR-373 alvos foram previamente identificados por microarray com RNA a partir de células HeLa transitoriamente transfectadas com um sintética miR-373 imitar [5]. Além disso, verificou-se estes mesmos 10 genes regulada para baixo em células MCF-7 que expressam miR-373 a partir do local AAVS1 (dados não mostrados). Portanto, esses 10 são prováveis ​​alvos válidos de miR-373. Estão em curso trabalhos para caracterizar a lista de potenciais alvos e tentar validar sucessos selecionados experimentalmente por RT-qPCR, Western blot e ensaio repórter luciferase.

Figura 1. Fluxo de trabalho para Biblioteca ID Target. Seções AC: Consulte as seções no procedimento. Cada passo é ilustrado e descrito em detalhe no Figs 2 e 3.

Figura 2. Transfecção e selecção Zeocin. A biblioteca de ID do alvo é um conjunto de plasmídeos (A), cada um com um ADNc humano inserido no 3'-UTR após uma proteína de fusão de timidina-quinase zeocin (TKzeo; Fig. 4). As células são transfectadas com Alvo ID Biblioteca (B) e deixou-se recuperar durante 3-5 dias. Construções podem integrar no genoma durante este período de recuperação (C), e expressar a transcrição codificado (D). Depois da recuperação, as células são expostas a zeocin (E). As células que expressam a proteína de fusão TKzeo a partir de construções de estavelmente integradas ID alvo sobreviver zeocin selecção (F). Células não transfectadas morrer (G). Além disso, quaisquer células contendo uma construção que é um alvo para um miRNA endógeno ou qualquer OTHfactor de er expresso na célula que inibe a expressão de TKzeo a partir da identificação de destino construto morrerão (H).

Figura 3. Transfecção e selecção miRNA ganciclovir. As células que contêm o alvo ID Biblioteca (isto é, zeocin-seleccionados células) são transfectadas com uma expressão de microRNA seleccionável construir (A). Durante a recuperação, a construção de expressão miRNA pode integrar (B) e expressar o marcador seleccionável codificada no miRNA construir. Após a selecção para a integração estável (C) e expansão das células, as células são tratadas com ganciclovir (D). Células produtoras de timidina-quinase (TK), na presença de ganciclovir (isto é, células que expressam TKzeo não construções alvo do miRNA) morrerão (E) Por outro lado, as células contendo construções de bibliotecas com miRNA alvo s ites não produzirá TK, e, portanto, irão sobreviver selecção ganciclovir (F). Células sobreviventes podem ser cultivadas, gDNA isolado, e os locais alvo de cDNA contendo miRNA amplificado por PCR utilizando os iniciadores de amplificação de destino ID. Os produtos de PCR podem ser sequenciados e alinhado com o genoma humano para identificar alvos miRNA.

Figura 4. Mapa Plasmid e Localização de primers de amplificação. Sfi I são os locais de clonagem de cDNA.

Sequências de primers

MISSÃO Alvo Primer de Amplificação ID 1

5 ACGACGTGACCCTGTTCATC 3

MISSÃO Alvo Primer de Amplificação ID 2

5 TAAAACGACGGCCAGTGAAT 3

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Figura 5. Efeito Ganciclovir no crescimento celular. Vinte e quatro placas de poços foram semeadas com 2-100.000 células MCF-7 ou células MCF-7 contendo a biblioteca de ID do alvo. Vinte e quatro horas mais tarde, o meio foi substituído com meio contendo 0, 8 ou 16 uM ganciclovir. Após 15 dias, a placa foi fotografado (6 poços superiores), em seguida, os poços foram lavados com HBSS e coradas com solução de coloração azul brilhante R (B6529) (6 poços inferiores). Note-se que o ganciclovir não tem efeito sobre células MCF-7, sem biblioteca porque eles não expressam timidina cinase (TK). Por outro lado, células MCF-7 Biblioteca fazer expressa TK mas não estão completamente mortos por ganciclovir menos 8 ou 16 uM, tal como mostrado pelas células vivas, tendo-se Brillinat Blue. No entanto, as células param de biblioteca crescendo em ganciclovir, como evidenciado pela cor do corante vermelho de fenol em seu meio. As células presos não acidificar o seu meio, ea cor avermelhada permanece em vez de alterar ouange-amarelo.

Reagente	Volume / Reacção
Jumpstart REDTaq mix Reação Readymix	10 uL
Primer amplificação 1 (25 uM)	0,2 ul
Primer amplificação 2 (25 mM)	0,2 ul
O DNA genômico	50-200 ng
Grau de água, Molecular	a 20 uL

Tabela 1.

Passo	Temp.	Tempo	Ciclos
Desnaturação inicial	95 ° C	5 min.	1
Desnaturação	95 ° C	30 seg.	PAN = "3"> 40 ciclos
Recozimento *	62 ° C	30 seg.
Extensão	68 ° C	2 min.
Extensão final	68 ° C	5 min.	1
Segurar	4 ° C	Segurar

Tabela 2.

* Temperaturas de recozimento podem variar, mas temos observado os melhores produtos de amplificação com temperaturas de recozimento que variam entre 53 e 64 ° C.

Tabela 3. Alvo conteúdo Biblioteca ID por seqüenciamento Illumina.

Tabela 4. MiR-373 alvos selecionados por seqüenciamento Illumina.

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Tabela 5. De 10 alvos previamente identificadas pela RNA microarray.

Discussão

microRNAs são RNAs de 20-24 nucleotídeos que regulam a expressão gênica pós-transcricional pela tradução do mRNA inibição e, freqüentemente, desestabilizar o mRNA alvo (revisto em [6]). Um único miRNA pode regular várias centenas de mRNAs para controlar a resposta de uma célula a sinais ambientais e de desenvolvimento. Identificação e validação de mRNAs alvo é essencial para determinar o papel de um miRNA e função nestas vias. No entanto, a identificação do alvo não é simples porque, em animais, miRNAs e seus locais-alvo não são totalmente complementares. A "semente" região, baseia 2 a 7 a partir da extremidade 5 'da miRNA, é geralmente complementar aos seus alvos. No entanto, existem muitas exceções à regra de sementes, ea jusante emparelhamento de bases pode compensar uma correspondência semente imperfeita. Um certo número de algoritmos de computador têm sido desenvolvidos para prever alvos miRNA baseado em correspondência de sementes e de compensação a jusante, uma estrutura alvoposição d, conservação da sequência, e vários outros parâmetros que têm sido observados para alvos validados experimentalmente (revisto em [7]). Enquanto in silico previsões são convenientes e se identificam muitos alvos miRNA válidos, a maioria previu genes falhar os testes de validação experimental, e muitos alvos reais não são previstos. Além disso, desde algoritmos de computador são baseados em características-alvo previamente determinados, eles não permitem a descoberta de alvos que se afastam do que já é conhecido.

Um certo número de sistemas experimentais têm sido utilizados com sucesso para identificar ou descobrir alvos miRNA funcionais em células vivas. Estes métodos de rastreamento globais incluem microarrays e sequenciamento de RNA, RNA co-imunoprecipitação (RIP), e Rotulagem Isótopos Estáveis ​​com Aminoácidos em cultura de células (SILAC), um método de proteômica (revisto em [7]). Cada método tem vantagens e desvantagens. Uma vez que miRNA segmentação frequentemente desestabiliza um mRNA e leva a sua degradação, uma perdar ganho no nível de ARNm após a introdução de um miRNA imitar ou inibidor, respectivamente, podem identificar alvos miRNA. Esta perda ou ganho de mRNA é facilmente detectada por microarray ou sequenciação de profundidade. Enquanto os métodos de detecção de mRNA são mais simples e mais sensível do que os métodos de detecção de proteínas, detecção de mRNA vai perder todos os alvos do miRNA que não são degradados. Relatórios recentes do laboratório Bartell comparando os resultados da detecção de miRNA-alvo RNA com os de SILAC [8] ou perfil ribossoma [9] indicam que os miRNAs mamíferos predominantemente agir, reduzindo os níveis de mRNA alvo. No entanto, muitos outros laboratórios que trabalham com metas de miRNA individuais detectaram alteração na proteína, mas nenhuma mudança no nível de mRNA. Relatos de que parece ser translacional regulação sem perda mRNA detectável incluem: miR-10b em HOXD10 [10], miR221/222 em p27KIP1 mostrou [11], miR-21 em Pdcd4 [12], miR-126 em p85β [13] , miR-34 em SIRT1 [14], miR-21 em PTEN [15], miR-302D em Arid4b [16], miR-200c em JAG1 [17], e miR-299, 297, 567, umnd 609 em VEGFA [18]. Além disso, Clancy et al [19] relatou recentemente que a regulação traducional por let-7 só foi detectado quando isoformas de RNAm individuais que contêm o local de let-7-alvo foram detectados de forma selectiva. A segunda sugere que, pelo menos em alguns casos, a regulação de translação pode ser negligenciada em um perfil compósito - isto é, quando todas as isoformas de mRNA são detectadas como uma mRNA - como obtido com microarray muitos e análise de sequências. Co-imunoprecipitação de miRNA mRNA complexos através Argonaute (geralmente ago2) ou outra proteína associada (RNA imunoprecipitação, ou RIP) vai isolar alvos miRNA independentemente do mecanismo de regulação. Além disso, RIP detecta endógena, e presumivelmente biologicamente relevantes, interacções. No entanto, não se sabe se todas as interacções miRNA de mRNA-são funcionais, e RIP perderia todos os objectivos de ARNm que se associam apenas transitoriamente ou são rapidamente degradados. Além disso, miRNA específicos de mRNA-parceiros deve ser inferida bioinformaticamente porque todos os pares de mRNA miRNA-co-precipitado em conjunto. Finalmente, SILAC directamente identifica o produto final de regulação miRNA, a própria proteína, mas é insensível e, portanto, perde proteínas raras e as pequenas alterações vezes nos níveis de proteína.

À luz das limitações com os actuais métodos de identificação de miRNA-alvo, sentimos um ensaio adicional global para identificar alvos miRNA funcionais por um mecanismo alternativo foi necessário. Para suprir essa necessidade, que licenciou uma tecnologia inventada por Joop Gaken e Mohamedali Azim de Faculdade Londres do rei. A invenção é uma proteína de fusão dupla selecção, especificamente, uma timidina-quinase de fusão zeocin, regulada por uma biblioteca de cDNA de sequências de miRNA potenciais alvo na sua 3'UTR. Células estavelmente transfectadas com e expressando TKzeo-cDNA construções podem ser seleccionados com zeocin, conforme ilustrado na Fig. 2. Depois de expressar um miRNA de interesse, as metas que miRNA pode ser selecionado with ganciclovir, como ilustrado na Fig. 3. Ganciclovir mata as células expressando timidina-quinase, ou seja, as células expressando TKzeo-cDNA falta um alvo para a miRNA de interesse. Targeted cDNA pode ser isolado por amplificação por PCR de DNA a partir de células que sobrevivem ganciclovir iniciadores utilizando que flanqueiam os produtos de cDNA, e PCR podem ser sequenciados para identificar alvos.

Temos desenvolvido tecnologia da Kings College em uma nova ferramenta para a identificação global e descoberta de metas funcionais miRNA humanos - a MISSÃO Biblioteca ID Target. Com a biblioteca de ID do alvo, os utilizadores podem isolar alvos miRNA por uma série de transfecção das células de mamíferos cultura e os passos de selecção de drogas. A Biblioteca é abrangente, e contém 66-79% de genes humanos. Os resultados iniciais indicam que tanto a descoberto anteriormente, bem como novos alvos podem ser isolados a partir da biblioteca ID MISSÃO alvo.

Embora o protocolo é de alguma extensão,uso da Biblioteca identificação de destino exige técnicas padrão de laboratório molecular - cultura de células de mamíferos, transfecção, a seleção de drogas, PCR, e seqüenciamento - e, portanto, deve ser bem no meio da maioria dos biólogos. Sugerimos que a atenção suficiente ser pago ao delineamento experimental adequado, otimizando as condições de cultura e, mais importante, pré-teste de cada novo tipo de célula para determinar os níveis ótimos de drogas para as etapas de seleção (matar-curvas) para garantir o sucesso com a Biblioteca ID Target.

Tal como acontece com todos os métodos de identificação de miRNA alvo, é altamente recomendável que os alvos identificados pela triagem da biblioteca ID do alvo ser validado com um segundo método, tal como microarray, qRT-PCR, o ensaio de repórter (isto é, luciferase), ou análise de Western.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de Catálogo	Comentários
JumpStart REDTaq Readymix	Sigma-Aldrich	P0982
Ganciclovir	Sigma-Aldrich	G2536
G418	Sigma-Aldrich	G8168
Puromicina	Sigma-Aldrich	P9620
Topo TA	Invitrogen	KNM4500-01
GenElute mamíferos Genomic DNA Miniprep Kit	Sigma-Aldrich	G1N10
Célula k Nucleofection específicaele	Lonza
Nucleofector	Lonza	AAD-1001
Zeocin	Invitrogen	R250-01
Identificação do destino Biblioteca	Sigma-Aldrich	MREH01