Produção e titulação de adeno-associados recombinantes Vetores Virais

Resumo

Recombinante adeno-associated virus (rAAVs) vetores estão se tornando cada vez mais valioso para In vivo Estudos em animais. Descrevemos como rAAVs pode ser produzido em laboratório e como esses vetores podem ser tituladas para dar uma leitura precisa do número de partículas infecciosas produzidas.

Resumo

Nos últimos anos recombinante adeno-associado vetores virais (AAV) tornaram-se cada vez mais valioso para estudos in vivo em animais, e também estão sendo testadas em ensaios clínicos humanos. Tipo selvagem AAV é um membro não-patogênico da família Parvoviridae e inerentemente replicação-deficiente. O perfil de transdução ampla, baixa resposta imune, bem como a expressão do transgene forte e persistente conseguido com esses vetores tornou-os uma ferramenta popular e versátil para in vitro e in vivo a entrega do gene. rAAVs pode ser fácil e barato produzido no laboratório e, com base em seu perfil de segurança favorável, são geralmente dada uma classificação de segurança baixos. Aqui, nós descrevemos um método para a produção e titulação de rAAVs quimérico que contenham as proteínas do capsídeo de ambos AAV1 e AAV2. O uso desses vetores chamados quimérico combina os benefícios de ambos os sorotipos dos pais, tais como estoques elevados títulos (AAV1) e purificaçãopor cromatografia de afinidade (AAV2). Esses sorotipos AAV são os melhores de todos os sorotipos estudados AAV, e individualmente têm um padrão de infectividade amplo. Os vetores quimérico descritas aqui devem ter as propriedades infecciosas do AAV1 e AAV2 e pode assim ser esperado para infectar uma grande variedade de tecidos, incluindo os neurônios, músculo esquelético, pâncreas, rim, entre outros. O método descrito aqui usa purificação coluna de heparina, um método acreditado para dar uma maior título viral e mais limpo preparação viral do que os métodos de purificação, tais como centrifugação num gradiente de cloreto de césio. Além disso, descrevemos como esses vetores podem ser rápida e facilmente tituladas para dar leitura exata do número de partículas infecciosas produzidas.

Protocolo

Veja a Figura 1 para uma ilustração resumindo o seguinte protocolo.

Nota de segurança: Todo o material que tem estado em contacto com partículas virais montado precisa ser desinfetado com solução de Virkon ou desinfetante adequado.

1. Preparação de estoques de DNA plasmidial (~ 2 dias)

1. Os plasmídeos são necessários os seguintes ^1:
   • pRV1 - Contendo a Rep AAV2 e seqüências de Cap
   • PH21 - Contendo a Rep AAV1 e seqüências de Cap
   • pFdelta6 - Adenovirus helper-plasmídeo
   • AAV plasmídeo contendo o cassete de expressão recombinante ladeado por AAV2 sinais de embalagem (repete terminal invertido, ITRs)
2. Enquanto pFdelta6 devem ser cultivadas em células Stbl2 competente para evitar a supressão parcial, e pRV1 PH21 podem ser cultivadas em células DH5alpha competente. Plasmídeos AAV podem ser cultivadas em células Stbl2 se deleções parciais ocorrem nas células DH5alpha.
3. Plasmídeo de DNA deve ser de alta qualidade e livre de contaminantes RNA. Plasmídeos podem ser rastreados para a integridade usando o seguinte digere:
   • pRV1 - digerir com XbaI para dar as bandas de 7,5 kb e 3,8 kb
   • PH21 - digerir com EcoRI para dar as bandas de 4,5 kb, 2,8 kb e 0,2 kb
   • pFdelta6 - digerir com HindIII para dar as bandas de 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb e 1,5 kb

2. Preparação de células embrionárias humanas Kidney 293 (Hek293) para transfecção (2-3 dias)

1. Placa de duas 80% confluentes 150 centímetros ^dois frascos de células em cinco Hek293 15 centímetros de diâmetro Nunc placas de cultura de tecido. As células devem ser 70-80% confluentes antes de transfecção (aproximadamente 48 horas após o plaqueamento). Cultura em células modificadas padrão Dulbecco Águia (DMEM) com glicose baixa contendo 10% de soro fetal bovino e 100 U / ml de penicilina / estreptomicina 100 mg / ml.
2. 3 horas antes de transfecção DMEM remover e substituir com Iscove'Medium s modificado Dulbecco (IMDM) contendo 5% de soro fetal bovino.

3. Transfecção de plasmídeos viral (~ 1 hora para transfecção, 3 dias para incubação)

1. Prepare o seguinte para um único lote (5 x 15 cm placas de cultura de tecido) do vírus:
   • 62,5 mg AAV plasmídeo
   • 125 mcg pFdelta6
   • 31,25 mg pRV1
   • 31,25 mg PH21
   • 1650 mL 2,5 M CaCl ₂
   • 12 ml dH ₂ O
2. Em um filtro de tecido classe 2 capô cultura estéril a mistura de transfecção em um tubo de 50 ml.
3. Enquanto vórtex a solução, adicionar rapidamente 13 ml de 2 x HEPES solução salina tamponada (pH 7,05). Substituir a tampa do tubo de 50 ml e continuar a vortex por 15 segundos. Deixar repousar por 1 minuto 45 segundos, um precipitado branco fino deve formulário.
4. Delicadamente adicionar 5 ml da solução de transfecção para cada 15 centímetros placa de cultura de tecidos. Placas agite para misturar e voltar a incubadora.
5. 16 horas após a transfecção remova o meio de IMDM e substituir com DMEM.

4. Lise de células e colheita de rAAVs (2 horas)

1. 72 horas após a transfecção, remova a mídia de placas de cultura de células e descarte. Todos os resíduos devem ser tratados com solução de Virkon ou desinfetante adequado.
2. Lavar cuidadosamente as células de fosfato de 1x quente solução salina tamponada (PBS, pH 7,4).
3. Adicionar 25 ml PBS quente para cada prato e retire cuidadosamente as células com um raspador de celular. Coletar suspensão em tubos de 50 ml.
4. Células pelota a 800 xg por 10 minutos.
5. Elimine o sobrenadante e ressuspender pellet em 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, use 10 ml por placa de cultura de tecidos. Dividido em dois tubos de 50 ml.
6. Prepare uma nova solução de desoxicolato de sódio a 10% em dH ₂ O. Adicionar 1,25 ml desta a cada tubo para uma concentração final de 0,5%. Adicionar benzonase nuclease a uma concentração final de 50 unidades por ml. Mix tubo completamente.
7. Incubar a 37 ° C por 1 hora.
8. Remover os restos celulares por centrifugação a 3000 xg durante 15 minutos. Transferir para tubo de 50 ml fresco, garantir que todos os restos celulares foi removido para evitar o bloqueio de colunas heparina (ver passo 5). Nesta fase, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C antes de continuar. Temos armazenado amostras por várias semanas a -20 ° C sem uma redução na infectividade.

5. Purificação coluna de heparina rAAVs (2-3 horas)

1. Setup colunas HiTrap heparina usando uma bomba peristáltica para que as soluções de fluxo através da coluna a 1 ml por minuto para as etapas de 5,2-5,4. É importante garantir que não haja bolhas de ar são introduzidas na coluna de heparina.
2. Equilibrar a coluna com 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0.
3. Aplicar solução de 50 ml de vírus para a coluna e deixar fluir.
4. Lavar coluna com 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0.
5. Usando uma seringa de 5 ml continuar a lavar a coluna wom 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, seguido de 1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0. Descartar o escoamento.
6. Usando 5 ml seringas e eluir pressão suave o vírus da coluna através da aplicação:
   • 1,5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
   • 3,0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
   • 1,5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
   • Coletar esses em um tubo de centrifugação de 15 ml.

6. Concentração e de filtração estéril de rAAVs (1 hora)

1. Concentre-se vetor usando Amicon ultra-centrífugas quatro unidades de filtro com um corte de peso molecular 100.000. Carga 4 ml de eluído no concentrador e centrifugar a 2000 xg por 2 minutos (em temperatura ambiente). Descartar fluxo contínuo e concentrador de recarga com solução vírus restantes e centrifugação repetir. O volume concentrado deve ser de aproximadamente 250 mL. Se o volume concentrado é significativamente mais do que isso, descarte o fluxo de through e continuar a centrífuga em um minuto, até que medidas de volume é de aproximadamente 250 mL.
2. Adicionar 250 mL de PBS ao vírus para um volume final de 500 mL e retire do concentrador.
3. Vector através de um filtro de 13 mm de diâmetro de filtro de seringa 0,2 mm. Vector deve ser aliquotado e estocado a -80 ° C até serem necessárias.

7. A titulação de ações viral (3 dias)

Isso requer um promotor que é ativo em células Hek293 dirigindo um gene repórter ou um produto de gene immunocytochemically detectável. Ao produzir um vetor que não é compatível com células Hek293 outras linhagens celulares ou culturas celulares primárias podem ser usados.

1. Prepare 18 poli-L-lisina lamínulas de vidro revestida ou 18 poços de slides câmara Nunc semeando Hek293 células para que eles sejam 40-50% confluentes. Para a titulação de Cre-dependente rAAVs uso Hek293 células que expressam estavelmente Cre recombinase ^2.
2. Infectar cada poço com série dilutions do vetor AAV (Fig 2A). Use 3 poços por diluição. Rotineiramente adicionar vírus diretamente a cada poço.
3. Após 72 horas fixar Hek293 células adicionando um volume igual de paraformaldeído a 4% (PFA) e médio (dando uma concentração final de PFA 2%) para 10 minutos em temperatura ambiente.
4. Lavar celular três vezes em PBS, lavar em dH ₂ O e lamela.
5. Contar o número de células transduzidas dos três poços que têm o maior fator de diluição, mas ainda contêm células infectadas, encontrar a média destes e multiplicar pelo fator de diluição para dar o número de unidades infecciosas por microlitro (Fig 2B).

8. Resultados antecipado

Hek293 células transduzidas com uma codificação do vírus proteína verde fluorescente melhorada (eGFP) são mostrados na Figura 2B. Em geral, alcançar títulos consistentes em torno de 6 x 10 ⁶ partículas infecciosas por micro litro. Nós usam rotineiramente esses vetores para estereotáxica injection no cérebro de roedores adultos. Isto proporciona uma técnica poderosa para a região específica de expressão gênica ^2. Para combinar esta especificidade região com células-tipo de expressão gênica seletiva injetamos Cre recombinase-dependente rAAVs em regiões alvo de Cre-camundongos transgênicos ^2. Figura 2C-E mostra exemplos de injeções estereotáxica de Cre-dependente rAAVs codificação eGFP em diferentes regiões do cérebro de adultos parvalbumina-Cre camundongos transgênicos ^3.

Figura 1. Ilustração esquemática do protocolo para a produção rAAV. 1.) Hek293 células são banhados e cresceu para 70-80% confluência. 2.) Plasmídeos AAV e ajudante são preparados e transfectadas em células Hek293. 3.) Medium é alterado novamente para DMEM 16 horas após transfecção e Hek293 células são cultivadas por mais 56 horas. 4.) Hek293 células são colhidas e lisadas. rAAV vetores são separados de restos celulares por centrifugation. 5.) Partículas virais são purificados através de colunas de heparina antes da concentração e esterilização. 6.) Hek293 células são cultivadas em 24 placas bem e infectar com diluições seriadas do vetor AAV para determinar o número de unidades infecciosas.

Figura 2. Titulação e em aplicação in vivo de rAAV1 / 2. (A) Instalação de Hek293 células para medir a título de viral. Hek293 células são transduzidas com diluições em série de rAAVs. C, o controle não infectados; N, 1 ml de ações virais não diluído. (B) Hek293 células infectadas com rAAVs expressar eGFP. (CE) expressão eGFP Viral é restrito a Cre-expressando neurônios nas regiões-alvo diferentes de camundongos transgênicos parvalbumina-Cre após a injeção estereotáxica de Cre-activated rAAVs. Imagens mostram exemplos imunorreatividade GFP em (C) pallidus do tálamo reticular e globus, (D) o giro denteado e (E) a região CA1 do hipocampo. DG, dentate giro; RT, reticular talâmico núcleo; GP, globo pálido. Barras de escala: B, 500 mm; C, 100 mm; D, 100 mm; E, 500 mm.

Discussão

vetores rAAV estão se tornando cada vez mais valioso para estudos in vivo em animais. Aqui, nós descrevemos um protocolo simples e barato para produzir rAAVs, o que pode facilitar a aplicação generalizada deste vector útil, evitando a terceirização onerosa de produção de vírus para as empresas. O protocolo (com base na referência 1) descreve a produção de quimérico rAAV1 / 2 vetores contendo proteínas do capsídeo de ambos os sorotipos dos pais em proporções iguais ^4. A purificação dos vetores rAAV por ligação a colunas de heparina depende da expressão de proteínas do capsídeo AAV2, mas pode ser combinado com outros sorotipos de AAV1 descritas aqui. Além disso, AAV6 tem sido relatada a ligam à heparina, embora com uma afinidade reduzida, e pode potencialmente ser purificados com colunas de heparina usando este procedimento ^5,6. Deve-se notar no entanto, que outros sorotipos vai exigir diferentes concentrações de NaCl para a heparina de eluição coluna ^5,7.

Genomas embalagem rAAV mostrou-se ideal entre 4,1 e 4,9 kb com uma forte redução na eficiência de embalagens até 5,2 kb ^8. Este limite de embalagem pode ser considerada a maior desvantagem do sistema rAAV, uma vez que células de tipo específico regulação da expressão do transgene é geralmente obtida por cis grande atuação elementos que não podem ser acomodados dentro de partículas de AAV de pequeno porte. Para superar lotes títulos baixos, tais como os resultantes da tentativa de genes pacote que estão perto do limite de embalagem AAV estamos combinando separar lotes viral concentrada a 250 mL em um lote 500 mL, ao invés de adicionar PBS, conforme descrito no passo 6.3. Transdução de células do tipo específico de confiança pode ser conseguido através da combinação de Cre-driver ratos e cassetes rAAV condicional (veja abaixo) para evitar esticar o limite de embalagem.

De nota, enquanto que este protocolo tenta fornecer fácil de seguir as instruções para a produção de t de altaiter rAAV, requer a presença de AAV2 metades proteína capsidial de purificação por cromatografia de afinidade a heparina. Outros sorotipos que AAV2 deve ser purificado através de procedimentos alternativos ^9. Uma vantagem de purificação coluna heparina é acredita-se para produzir vetores de AAV que têm maior taxa de infectividade do que aqueles produzidos através de um gradiente de cloreto de césio ^10. No entanto, também existem algumas desvantagens para este método. Por exemplo, outras proteínas que se ligam a heparina também podem estar presentes no estoque purificada viral. Enquanto o tropismo de heparina-purificada vetores podem ser influenciados pelo título vector ^10, a nossa abordagem especificamente alvo ou ²⁰ excitatória ou inibitória neurônios (Fig. 2) emprega Cre induzida por ativação de AAV-mediada expressão do transgene e é independente do título. Uma alternativa para purificação coluna heparina é o uso de um gradiente de densidade iodixanol, que produz um título maior viral e preparação mais pura do que o uso deum gradiente de cloreto de césio ^10. Este método também pode ser combinado com coluna de purificação de heparina para produzir um vetor que é superior a 99% de pureza ^11. Portanto, a consideração cuidadosa deve ser tomado por grupos individuais a respeito de qual método de purificação viral é melhor para sua aplicação em particular a jusante.

O problema mais comum associado a este protocolo é título de viral baixa. Em nossa experiência esta pode geralmente ser atribuída a eficiência de transfecção baixo, ou a eluição dos vírus das colunas heparina. Todos os materiais de transfecção devem estar à temperatura ambiente antes de transfecção e transfections teste deve ser realizado para encontrar as condições ideais em cada laboratório. Outros métodos de transfecção, como lipofectamine, são altamente eficientes, mas pode ser proibitivamente caro. Além disso, a concentração e pH das soluções de eluição heparina coluna é fundamental para a eluição completa de virions de witho colunas heparinadanos ut. Outro ponto importante é que as células de embalagem devem aderir bem à superfície das placas de cultura de tecido. Se as células destacar em algum momento durante o procedimento é aconselhável para encerrar o experimento e descongelar um novo frasco de células.

Espaço-temporal de controle de expressão do transgene em roedores é facilmente alcançado por segmentação anatômica precisa e do estágio de desenvolvimento do animal. Transferência de genes mediada por AAV eficiente tem sido mostrado no útero ^12,13. No cérebro adulto, a área infectada com partículas rAAV após a injeção estereotáxica pode ser ajustado de muito pequenas regiões-alvo, para áreas muito maiores, não só por mudanças no título viral, mas também alterando os parâmetros de injeção. Estes incluem o volume ea velocidade das injeções ea inclusão do manitol poliol com a suspensão de vírus ^14. Manitol pode também ser usado para melhorar a infecção de uma variedade de tecidos após a injeção sistêmica rAAV ^{15 <}/ Sup>.

A capacidade de acondicionamento de rAAV (aproximadamente 4,7 kb) é provavelmente o fator mais limitante em termos de genes que podem ser expressas a partir destes vetores virais. No entanto, estudos recentes têm mostrado que isso pode ser parcialmente superada pela divisão de genes maiores ou cassetes de expressão em vetores separados rAAV e introduzindo uma seqüência de transição, iniciando a expressão do gene, quando virions infectam a mesma célula ^16. Níveis de expressão de genes realizada por vetores rAAV também pode ser bastante reforçada, usando vetores auto-cortesia rAAV ^17. Injeção estereotáxica de vetores rAAV fornece um método rápido, barato e eficaz para induzir a expressão do gene de uma forma específica da região. Em combinação com 2 ^ª geração estratégias de interferência de RNA ¹⁸ rAAVs também podem ser usados ​​para a região específica do gene-knock down. rAAVs pode ser combinado com Cre-transgênicas ratos ou de células do tipo promotores específicos para alcançar-circuito e célula-tipoEspecíficos de expressão gênica, permitindo manipulações genéticas com alta resolução espacial ^2,19-21, enquanto rAAVs montagem com o sistema tet por exemplo, a soma de controle temporal sobre vírus mediada expressão gênica ^22,23. Estes exemplos ilustram o enorme potencial combinatorial desses vetores e prever um rápido aumento na rAAV baseado em estudos ao longo dos anos por vir.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Amicon Ultra filtros centrífugos	Millipore	UFC810024	100.000 MWCO
Benzonase nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Modificado Dulbeco de Águia (DMEM)	Invitrogen	10567014	Suplemento com 10% SFB e 10 unidades / ml penicillin/100 estreptomicina mg / ml
Hek293 células	Americana colecção de culturas tipo	CRL-1573	Use a passagem menos de 30
HEPES solução salina tamponada	Sigma-Aldrich	51558
HiTrap Heparina cartucho	Sigma-Aldrich	54836
Meio modificado de Dulbecco Iscove	Invitrogen	12440-053	Suplemento com FCS 5%
Desoxicolato de sódio	Sigma-Aldrich	D5670	Faça solução nova para cada lote
15 centímetros cultura pratos Tissue	Fisher Scientific	157150
Stbl2 células competentes	Invitrogen	10268-019
Solução Virkon	Fisher Scientific	NC9821357	Deixe para desinfectar noite antes de descartar a drenar