De alto rendimento cristalização de proteínas de membrana Usando o método Bicelle lipídico

Resumo

Bicelles são misturas de lipídios / anfifílico que mantêm as proteínas da membrana (MPs) dentro de uma bicamada lipídica, mas têm comportamento de fase única que facilita high-throughput screening por robôs de cristalização. Esta técnica, com sucesso, produziu uma série de alta resolução de estruturas de ambas as fontes procariotas e eucariotas. Este vídeo descreve os protocolos para gerar a mistura bicelle lipídico, incorporando MPs na mistura bicelle, a criação de cristalizações ensaios (manualmente, assim como robotically) e cristais de colheita do meio.

Resumo

Proteínas da membrana (MPs) desempenham um papel fundamental em muitos processos fisiológicos como o bombeamento de moléculas específicas através da bicamada de membrana de outra forma impermeável que circunda todas as células e organelas. Alterações na função do resultado MPs em muitas doenças e distúrbios humanos, portanto, uma compreensão complexa das suas estruturas continua a ser um objectivo fundamental para a pesquisa biológica. No entanto, a determinação da estrutura de deputados continua a ser um desafio significativo, muitas vezes decorrentes de sua hidrofobicidade.

MPs têm substancial regiões hidrofóbicas embutido dentro da bicamada. Detergentes são freqüentemente usados ​​para solubilizar estas proteínas a partir da bicamada gerando uma micela da proteína-detergente que podem ser manipulados de forma semelhante como proteínas solúveis. Tradicionalmente, os ensaios de cristalização continuar usando uma mistura de proteína-detergente, mas eles muitas vezes resistem a cristalização ou produzir cristais de má qualidade. Estes problemas surgem devido aoincapacidade de detergente para imitar a bicamada adequadamente, resultando em pouca estabilidade e heterogeneidade. Além disso, os escudos de detergente a superfície hidrofóbica do MP reduzindo a área de superfície disponível para contatos de cristal. Para contornar esses inconvenientes MPs pode ser cristalizada na mídia lipídico, que mais de perto simula seu ambiente endógeno, e recentemente se tornou uma técnica de novo para a cristalização MP.

Fase cúbicos lipídico (LCP) é uma bicamada lipídica tridimensional penetrado por um sistema interligado de canais aquosa ^1. Embora monoolein é o lipídio de escolha, lipídios relacionados, tais como monopalmitolein e monovaccenin também têm sido usados ​​para fazer LCP ^2. MPs são incorporados ao LCP onde difusa em três dimensões e núcleos de cristal feed. A grande vantagem da LCP é que a proteína permanece em um ambiente mais natural, mas o método tem uma série de desvantagens técnicas, incluindo Visc altaosity (exigindo aparelhos especializados) e dificuldades na visualização e manipulação de cristal ^3,4. Devido a estas dificuldades técnicas, utilizamos outro meio lipídico para a cristalização-bicelles ^5,6 (Figura 1). Bicelles são misturas de lipídios / anfifílico formado pela mistura de um lipídio fosfatidilcolina (DMPC) com um anfifílico (CHAPSO) ou um lipídio de cadeia curta (DHPC). Dentro de cada disco bicelle, as moléculas de lipídios gerar uma bicamada, enquanto a linha de moléculas anfifílico as bordas apolar fornecendo propriedades benéficas de ambas as bicamadas e detergentes. Importante, abaixo de sua temperatura de transição, proteína bicelle-misturas têm uma viscosidade reduzida e são manipulados de forma semelhante como detergente solubilizado MPs, fazendo bicelles compatível com robôs de cristalização.

Bicelles tem sido utilizado com sucesso para cristalizar proteínas de membrana várias ^5,7-11 (Tabela 1). Esta coleção crescentede proteínas demonstra a versatilidade do bicelles para cristalizar o alfa helicoidal e deputados folha beta a partir de fontes procariotas e eucariotas. Devido a estes êxitos e da simplicidade de alto rendimento, implementação bicelles deve ser parte do arsenal cada cristalógrafo proteína membrana. Neste vídeo, descrevemos a metodologia bicelle e fornecer um protocolo passo a passo para a criação de estudos de alto rendimento cristalização de MPs purificada usando a robótica padrão.

Protocolo

Bicelle cristalização base é composta por quatro passos básicos (Figura 2): i) preparação de um lipídio bicelle formando: mistura anfifílico; ii) incorporação de proteína purificada no meio bicelle; iii) Os ensaios de cristalização (manualmente ou robotically) e iv) visualização de extração de cristal, e de congelamento. Essas etapas são descritas em detalhes abaixo

1. Preparação de Bicelles

Bicelles pode se formar em uma variedade de lipídios: combinações anfifílico e em uma ampla faixa de concentrações. Portanto, uma composição baseada inicial sobre as condições anteriores de sucesso é recomendado (Tabela 1). A mistura de maior sucesso é o DMPC: CHAPSO bicelle formulação, que pode ser adquirido comercialmente como uma formulação pré-misturada ready-to-use (ver Tabela de Reagentes abaixo) ou preparadas em laboratório, conforme descrito. Para este exercício vamos preparar 1 ml de DMPC 35%: mistura CHAPSO na proporção 2,8:1 molar.

1. Pesar 0,26 g DMPC (Sr. 677,9 g / mol), 0,09 g CHAPSO (Sr. 630,9 g / mol) e adicione água deionizada para um volume final de 1,0 ml.
   • O percentual bicelle pode variar entre 10% -40% com uma DMPC: razão molar CHAPSO desde 2.6-3.0:1 (Tabela 1).
   • Nota: Quanto maior a concentração bicelle o mais difícil é para dissolver o lipídio, resultando em uma viscosidade mais elevada solução. No entanto, uma formulação bicelle concentrada pode ser vantajoso quando a concentração de proteína é baixo.
2. Dissolvendo os lipídios para obter uma solução homogênea requer um esforço considerável, tornando este o passo mais demorado no método bicelle. Percorrer os seguintes passos até que o DMPC está completamente misturado:
   1. Aquecer a mistura para ~ 40 ° C em banho-maria ou uma incubadora e vortex de ~ 1 minuto.
      • Nota: Como mais ciclos são realizados, o aquecimento da mistura resultará em uma con gel-likecia o que torna difícil vortex.
   2. Arrefecer a mistura sobre o gelo e vortex por alguns minutos. Cooling ajuda a liquefazer a solução facilitando a vortex.
      • Nota: Como mais ciclos são realizados, a mistura pode tornar-se turva com o resfriamento.
   3. Repita os passos listados acima (1.2.1 e 1.2.2) até que o lipídio é completamente dissolvido.
      • Nota: Este processo pode demorar várias horas. Formação Bicelle é indicado pelas mudanças no comportamento de fase da DMPC: formulação CHAPSO. Após a conclusão, a mistura será um gel transparente em ou acima da temperatura ambiente e um líquido viscoso no gelo.
3. A mistura bicelle está pronto para usar e pode ser mantido a -20 ° C para armazenamento de longo prazo (até 5 anos). Devido ao risco de hidrólise do grupo cabeça de fosfolipídios, não é aconselhável para armazenar bicelles à temperatura ambiente por longos períodos.

2. Incorporação de proteína em bicelles

A maioria das estruturas MP obtidos bicelles foram cristalizados em DMPC: CHAPSO bicelle concentração variando de 2 a 8% usando uma concentração de proteína de 8 a 12 mg / ml (Tabela 1). Se possível, as telas iniciais devem usar essas orientações e concentrações adicionais podem ser selecionados na fase de otimização. Em comparação com o método LCP, a incorporação de proteínas com bicelles é um processo simples (Figura 3), que deve ser feito no mesmo dia como ensaios de cristalização.

1. Descongele o DMPC: CHAPSO mistura bicelle à temperatura ambiente até as mudanças de fase para um gel transparente.
   • Nota: Vários freeze-thaws não vai afetar o comportamento bicelle.
2. Coloque a mistura em gelo para liquify e brevemente vortex para restabelecer uma fase bicelle homogênea. Quando colocado sobre o gelo a mistura torna-se turva.
3. From esse ponto em diante, manter a mistura bicelle e proteína purificada no gelo. Isto irá manter o bicelle em uma fase líquida tornando-o passível de pipetagem.
4. Adicione a mistura bicelle à proteína purificada detergente solubilizado em uma proporção de 1:4 (V / V).
   • Por exemplo: 100 mistura proteína-bicelle mL é obtido através da mistura de 80 mL de proteína com 20 bicelle mL. Se a concentração de proteína é de 15 mg / ml ea concentração bicelle é de 35%, isto dará uma mistura de proteínas bicelle-incorporada com uma concentração de proteína de 12 mg / ml e uma concentração bicelle de 7%.
5. Misture com cuidado pipetando o conteúdo cima e para baixo até que a solução torna-se clara e homogênea.
   • Nota: Se surgirem bolhas, um giro rápido (30-60 segundos, 13000 rpm, 4 ° C) com uma centrífuga de mesa pode ajudar a removê-los.
6. Incubar a mistura sobre o gelo por pelo menos 30 min para promover a incorporação completa de proteínas into bicelles. A mistura de proteínas bicelle está agora pronto para ensaios de cristalização.

3. Criação de ensaios de cristalização

Técnicas de cristalização de lipídios outras como a LCP exige equipamento especializado, devido à alta viscosidade do meio, mas o comportamento de fase única de bicelles permite aplicação em praticamente todos os formatos de cristalização qualquer padrão, incluindo robótica (Figura 3). Ensaios de cristalização pode ser realizada em qualquer suspensão ou estar usando formatos padrão de queda telas disponíveis no mercado.

1. Se a criação de bandejas manualmente ou usando um robô de cristalização, manter a mistura de proteína bicelle-on ice. Isto irá manter o frio mistura protéica bicelle e garantir que a viscosidade da solução é mínima.
2. Ensaios de cristalização Manual - Com uma pipeta padrão, a mistura de proteína bicelle pode ser misturado com uma solução reservatório da mesma maneira como realizar normalmenteed para proteínas de membrana solúvel ou detergente solubilizado.
   • Nota: Mantenha a mistura proteína-bicelle em gelo durante os ensaios.
3. Ensaios de cristalização robótico - Temos adaptados estes ensaios para o robô cristalização Mosquito, mas, em princípio (seguir as mesmas precauções) a técnica deve ser compatível com todos os robôs de cristalização. As dicas a seguir irão garantir que a mistura de proteína bicelle mantém-se fresco e com precisão pipetado pelo robô:
   1. Precool a placa segurando a mistura proteína-bicelle, colocando-o no gelo.
   2. Pipeta a mistura proteína-bicelle na placa e continuar a manter a placa de gelo. Esta placa deve ser o último item a ir no robô antes de começar a correr.
   3. Set-up na bandeja do reservatório e tampas de cristalização na plataforma 3 e 5, respectivamente, do robô mosquito.
   4. Coloque a placa contendo proteínas bicelle mistura na plataforma 4do robô mosquito. Isso garante a mistura de proteína bicelle é o último a ser pego pelo robô e é liberada imediatamente.
   5. Para evitar um aquecimento e aumento da viscosidade, não misture o reservatório com a mistura de proteínas bicelle.
   6. Ao realizar várias telas, retornou imediatamente a placa bicelle proteína para o gelo para o resfriamento, logo que uma corrida seja concluída.
4. Volume da gota e ratio (proteína: reservatório) pode ser escolhida como para ensaios de cristalização convencional. Por exemplo, ensaios de cristal inicial usando o robô Mosquito pode ser configurada usando 0,25 mL de proteína: mistura bicelle mais 0,25 mL reservatório.
5. Incubar os ensaios de cristal em uma câmara a 20 ° C. Temperatura é uma boa triagem e parâmetro de otimização, porque o comportamento de fase de bicelles é dependente da temperatura.
   • Temperaturas mais elevadas induzem a fase lamelar ¹² (Figura 1), que tem a vantagem de pré-organizaçãoa proteína em camadas. Temperaturas abaixo de 20 ° C pode ser selecionado, mas você não deve ir abaixo de 4 ° C uma vez que este pode causar os lipídios para precipitar durante longos períodos de tempo.
6. Da mesma maneira como ensaios de cristalização tradicionais, ensaios bicelle deve ser monitorado em uma base regular para a aparência de cristal e de crescimento. Recomendamos para verificar as bandejas no 1 ^º e 3 ^º dia pós-instalação seguido por inspeção semanal.
7. Otimização de cristal pode ser realizado através de métodos de rotina usado em cristais detergente baseada incluindo o rastreio de grade, o rastreio aditivo, alterando etc temperaturas Além disso, a porcentagem bicelle e relação proteína: bicelle pode ser variada. Além disso, bicelles pode ser dopado com lipídios específicos que possam ser necessárias para a estabilidade da proteína ou função.

4. Visualização de extração de cristal, e de congelamento

Desde os ensaios de cristal com a mistura de proteína bicelle- tem uma viscosidade semelhante à proteína-detergente gotas, visualização e extração de cristal é rotina e é realizado como tradicional set-ups.

1. Visualização: Em contraste com a mídia LCP que muitas vezes exige alta qualidade de iluminação com luz normal e polarizada para detecção de cristal, a visualização não seja dificultado pela bicelles. Gotas de cristal colorido, bem como incolor proteína pode ser facilmente analisados ​​usando microscópios padrão e nenhum equipamento especial é necessário.
2. Bicelles, como qualquer outro meio lipídico, tendem a produzir uma alta porcentagem de falsos positivos. Um microscópio UV ajuda muito na diferenciação de proteínas a partir de cristais de sal (Figura 4).
3. Extração e congelamento: a extração de cristal e congelamento é relativamente simples e não requer a dissolução da mídia bicelle circundante. Além disso, a fase bicelle próprio fornece alguns moderada crio-proteção.

5. Resultados representativos:

nt "> Geralmente, leva 2-3 dias para aparecer e cristais para aproximadamente uma semana ou mais para que cresçam ao seu tamanho máximo. Este foi o caso de bacteriorodopsina e canal de ânion do mouse voltagem-dependentes 1 (mVDAC1) cristais de ^4,8 . Para outras proteínas da membrana que pode levar várias semanas para o crescimento de cristal, por isso é importante continuar a acompanhar os ensaios de cristal muito além das primeiras semanas.

Tal como com outros meios de comunicação lipídico, bicelles tendem a formar formas que podem aparecer a ser cristalina. Também foi observado que elas conduzem a uma maior percentagem de sal e cristais de detergente. A UV-microscópio que detecta a fluorescência de triptofano pode significativamente ajudar a eliminar tais não-proteico de falsos positivos. A Figura 4 mostra as formas de lipídios, sal e cristais de proteínas como vistas à luz visível e UV para ajudar a distinguir os diferentes resultados que podem ser observadas.

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Figura 1. Bicelle esquemática. Bicelles são compostos de uma molécula de lipídio bicamada formando como DMPC (azul) e um anfifílico como CHAPSO (verde), que protege as bordas hidrofóbicas da bicamada. Como a temperatura é aumentada, como disc-bicelles passar por uma transformação de fase em uma chapa perfurada ¹² lamelar.

Figura 2. Fluxograma para o método de cristalização bicelle delineando os quatro passos básicos.

Figura 3. Ensaios Cristal esquemática set-up. Proteínas purificadas detergente solubilizado de membrana podem ser diretamente misturado com bicelles no gelo simplesmente pipetagem o conteúdo juntos. Após incubar a mistura proteína / bicelle no gelo para ensaios ~ 30 minutos, a cristalizaçãopode ser configurado com qualquer formato standard, incluindo robótica.

Figura 4. Visualização de ensaios de cristal. Imagem visível (painel superior) e de imagem UV (painel inferior) de (A) da agulha em forma de cristais observados em uma condição-sal apenas. Ausência de fluorescência pode ser detectada a partir dos cristais, uma indicação de falso positivo. (B) Rod-shaped cristal formado em uma condição MPD. O cristal de fluorescência fraca, mas foi encontrado para ser não-proteico usando difração de raios X. (C) Crystal observadas cerca de quatro semanas após a criação de testes. A fluorescência sob luz UV forte confirma que é um cristal de proteína.

Não.	Proteína	Fonte	Formulação Bicelle	Proteína Concentratiem	Detergente 1	Resolução (Å)	Referência
1	Bacteriorodopsina 2	Halobacterium salinarum	8% DMPC: CHAPSO (2,8:1)	8 mg / ml		2,0	Faham e Bowie, 2002
			8% DTPC: CHAPSO (3:1)	8 mg / ml		1,8	Faham et al., 2005
2	β2-adrenérgicos / complexo Fab	Homo sapiens	8,3% DMPC: CHAPSO (3:1)	10 mg / ml	DDM	3.4/3.7	Rasmussen et al., 2007
3	Voltagem-dependentes canal anion 1	Mus musculus	7% DMPC: CHAPSO (2,8:1)	12 mg / ml	LDAO	2,3	Ujwal et al., 2008
4	Xanthorhodopsin	Salinibacter ruber	4,2% DMPC, NM 5%	4 mg / ml	DDM	1,9	Luecke et al., 2009
5	Protease rombóide	Escherichia coli	2% DMPC: CHAPSO (2,6:1)	9 mg / ml	Glucoside nonil	1,7	Vinothkumar de 2011

Um detergente usado para purificação de proteínas de membrana
2 Native lipídios das membranas roxo pode ser realizada ao longo durante a depuração

Tabela 1. Resumo das condições de cristalização de estruturas de proteínas de membrana resolvidos usando bicelles.

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Discussão

Bicelles são uma mídia única lipídico que oferecem um ambiente bicamada-like nativa, enquanto se comportando como se solubilizados pelos detergentes. Esta propriedade dá bicelles uma vantagem distinta sobre outros métodos de lipídios baseados em cristalização, pois não há curva de aprendizagem ou equipamento especializado necessário para esta técnica. Uma vez bicelles estão disponíveis, seja comercial ou preparados em laboratório, eles podem estar diretamente misturado com proteína purificada e deste po...

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