Um Protocolo para Detecção e eliminação em fase gasosa radicais livres do fumo do cigarro Mainstream

Resumo

Spin-trapping espectroscopia ESR foi usado para estudar o efeito de antioxidantes vegetais licopeno, pycnogenol e extrato de semente de uva na limpeza de fase gasosa de radicais livres na fumaça do cigarro.

Resumo

O tabagismo está associado a cânceres humanos. Tem sido relatado que a maioria das mortes por câncer de pulmão são causados ​​pelo tabagismo ^5,6,7,12. Embora alcatrões tabaco e produtos afins na fase de partículas da fumaça do cigarro são as principais causas de doenças cancerígenas e mutagénicas relacionados, a fumaça do cigarro contém quantidades significativas de radicais livres que são também considerados como um importante grupo de substâncias cancerígenas ^9,10. Os radicais livres atacam componentes da célula por danificar a estrutura da proteína, lipídios e sequências de DNA e aumentar os riscos de desenvolver vários tipos de cânceres. Radicais inalados produzem adutos que contribuem para muitos dos efeitos negativos sobre a saúde do fumo do tabaco no pulmão ^3. Estudos têm sido realizados para reduzir os radicais livres da fumaça do cigarro para diminuir os riscos dos danos provocadas pelo tabagismo. Tem sido relatado que a hemoglobina e heme contendo compostos poderiam parcialmente scavenge óxido nítrico, reativaoxidantes e cancerígenos nitrosocompounds voláteis de ⁴ de fumaça de cigarro. A 'bio-filtro "consistia de carbono hemoglobina e ativado foi utilizado para eliminar os radicais livres e para remover até 90% dos radicais livres da fumaça do cigarro ^14. No entanto, devido ao custo ineficácia, não foi comercializada com sucesso. Outro estudo mostrou a eficiência de limpeza de boa shikonin, um componente da fitoterapia chinesa ^8. No presente estudo, relatamos um protocolo comum para a introdução de extratos de antioxidantes naturais para o filtro de cigarro para limpeza de radicais livres em fase gasosa na fumaça do cigarro e medição do efeito scavenge em radicais livres em fase gasosa na fumaça do cigarro mainstream (MCS), utilizando-spin trapping ressonância paramagnética eletrônica (ESR) Espectroscopia ^1,2,14. Nós mostramos capacidade de limpeza de alta de licopeno e extrato de semente de uva, que poderia apontar para sua futura aplicação em filtros de cigarro. Uma vantagem importante destes profissionaiscatadores pectiva é que eles podem ser adquiridos em grande quantidade a partir de subprodutos da indústria de tomate ou de vinho, respectivamente, ^11,13

Protocolo

1. Materiais

Todos os solventes utilizados neste trabalho foram de grau reagente. A armadilha de spin, incluindo N-terc-butil-α-phenylnitrone (PBN) eo rótulo de spin padrão 2,2,6,6-tetrametil-1-piperinyoxyl (TEMPO) foram obtidos da Sigma e foram usados ​​como fornecido. Os antioxidantes de plantas foram obtidas comercialmente a partir de Swanson, Inc. nos EUA.

2. Preparação de fumaça de cigarro e análise de radicais livres

1. Introduzir antioxidantes no filtro, o Pycnogenol antioxidantes e extrato de semente de uva foram pela primeira vez dissolvido em etanol a 95%, enquanto o licopeno foi dissolvido em acetona. Os volumes de solvente foram diferentes, dependendo da solubilidade antioxidante.
2. A quantidade de antioxidantes de 0,4 mg / filtro foi usado. Eles foram, então, revestido com 10 mg de carvão ativado. Para este efeito, carvão ativado foi agitada por ~ 12 hrs com a solução antioxidante em condições anaeróbicas, filtrado e seco sob vácuo.
3. Antioxidantes foram então introduzidas no filtro de acetato de convencional (CA filtro). Para este propósito, o filtro foi cortado em dois pedaços. O revestimento vegetal antioxidantes foram inseridos entre dois pedaços do filtro e embrulhado com um pedaço de fita adesiva para formar um filtro - antioxidante-filtro sanduíche (Fig. 1A). Este filtro combinado foi posteriormente anexado ao varas de cigarros contendo tabaco. O controle de filtro foi feita da mesma forma como o filtro de antioxidantes, exceto nenhum antioxidante foi adicionado.
4. Antes da simulação de fumar, os cigarros pesquisa foram desembalados e mantidos em um ambiente de umidade constante (20 ° C, 60% de umidade relativa) usando uma solução de NaBr saturada para um mínimo de 2 dias.
5. Simulação de fumar para análise de rotina foi realizada à temperatura ambiente usando um dispositivo de fumo de um único porto que, como mostrado na Figura 1, consiste de um aspirador de água ou bomba de vácuo GAST DOA-BN-P104 / Air Compressor (Benton Harbor, Michigan) conectado para o spin-trappingmontagem através de um entroncamento com uma extremidade aberta. Puffs foram realizados, ligando a extremidade aberta que permaneceu aberta entre baforadas. O fluxo de gás foi verificada pelo medidor de vazão e fixada em 2,2 ~ SCFH = 17,5 mL / s através do ajuste de uma válvula colocada entre a bomba eo vent.
6. Os cigarros eram fumados de pesquisa sob a condição de volume de sopro de 35 ml para uma duração de 2 segundos repetida a cada 60 segundos, semelhante ao ^1. Simulação de fumar para a estimativa quantitativa de fase gasosa de radicais livres foi realizada em conjunto com o sistema de armadilha de spin como mostrado na figura. 1.
7. Dez puffs intensa (35 mL / puff) foram tomadas para cada cigarro. Fase gasosa de radicais livres foram coletadas pela passagem do MCS através de um filtro Cambridge pad e depois introduzido na solução de spin trapping (0,05 M PBN em benzeno, 2,0 mL).
8. Após a última tragada, a solução armadilhas bolhas foi reajustado ao seu volume inicial (2,0 mL) com o benzeno mesmo. Uma alíquota foi transferida para uma 25 ~0 milímetros de comprimento, 3 milímetros tubo de vidro ID selado numa das extremidades.
9. A solução foi desoxigenada armadilhas usando um procedimento de congelamento-descongelamento-bomba. Foi congelados com azoto líquido, e um vácuo foi aplicado. Em seguida, ele foi descongelado sob atmosfera de argônio, permitindo que as bolhas de gás presas a escapar, e congelado novamente. Após este ciclo foi repetido três vezes, o tubo foi chama-selado a vácuo e usados ​​em outras medições ESR. Esta etapa é necessária porque o oxigênio, que é bem solúvel em benzeno, amplia linhas ESR de radicais orgânicos. Desoxigenação dramaticamente melhora a relação sinal-ruído.
10. X-Band ESR espectros foram registrados em um espectrômetro Bruker EMX em uma freqüência de 9,34 GHz em condições normais. As configurações espectrômetro utilizado na maioria dos experimentos foram: centro do campo 3312.5G, largura de digitalização 80G, modulação de amplitude 0.5G, constante de tempo 82 microsegundos, tempo de digitalização 40 segundos.
11. Os adutos armadilha de spin são relativamente estáveis ​​nas condições de experimento, que em alguns casos required 25 acumulações, que normalmente levava ~ 20 min. No entanto, após 12 horas a intensidade dos sinais de ESR em solução de benzeno diminuiu por um fator de ~ 5.
12. Para quantificar a concentração do aduto armadilhas, seu espectro ESR inicial de primeira derivada foi integrado. O espectro de absorção resultante mostra um fundo singlet amplo, provavelmente devido a fuligem / tar produtos contidos na fumaça.
    
    Após a subtração deste contexto, o trio separados do aduto armadilhas foi integrado mais uma vez (Fig. 2).

3. Resultados representante

A maioria dos radicais livres na queima de cigarros produzidos fumaça (fase gasosa) são instantâneos e instável. A fim de observar esses radicais uma técnica armadilha de spin é empregado. Ele captura de fase gasosa de radicais livres, transformando-os em um aduto de spin que é mais estável e pode ser detectado por ESR (Fig.1). No presente estudo, a solução de spin-armadilha de 0,05M PBN foi usado para coletar o gás de fumaça fase de radicais livres, que são uma mistura de oxigênio e carbono-centrado radicais que são difíceis de separar ^15. No nosso caso, no entanto, as constantes divisão observada hiperfinos um _N = 13.7G e um _H = 1.95G são muito semelhantes aos valores correspondentes para a captura de adutos alcoxil radicais livres (Rm) ^2, sugerindo que eles são o produto principal. Nós mostramos que sinais fracos ESR e baixa reprodutibilidade observada em nossas medições iniciais (Fig. 2) foram devido à umidade do fluxo de fumaça. Para resolver esse problema, nós adicionamos uma armadilha de nitrogênio líquido (LN2) entre o filtro de Cambridge ea solução armadilha spin. A LN ₂ armadilha de água removida do fluxo de MCS por congelamento rápido e capturá-lo na parede interna do tubo de vidro. Esta muito melhorada sinais ESR e permitiu resultados altamente reprodutível (Fig. 3).

A quantidade de presos radicais livres foi determinada utilizando umamostra de referência. Para amostras de controle sem antioxidantes, a concentração de benzeno no aduto típico estimada por comparação de seu espectro dupla integral com um espectro de casal integrante de concentração conhecida de O TEMPO foi de 1,24 mM (Fig.2). Uma vez que a quantidade de ar passou por cada cigarro durante a fumar foi de ~ 350 ml, o que dá uma estimativa para a concentração de radicais livres na fase gasosa da MCS de ~ 7.1X10 ^-9 M, e um número total de radicais presos da fase gasosa de um cigarro inteiro de ~ 1.5x10 ^15. Uma estimativa para a quantidade total de radicais livres na fumaça de um cigarro inteiro, incluindo o gás ea fase particulada, foi de ~ 10 ¹⁶ radicais livres ^9.

Diferentes níveis do efeito de limpeza de plantas antioxidantes em fase gasosa de radicais livres na fumaça do cigarro fluxo principais foram observados. Suas taxas de limpeza foram apresentados na fig. 4. Licopeno e extrato de semente de uva apresentaram as maiores taxas, enquanto baixaer taxa foi observada para picnogenol (Fig.4).

Figura 1. Um diagrama de uma melhor concepção de fumar de simulação para a recolha de fase gasosa de radicais livres na fumaça do cigarro mainstream (MCS), utilizando armadilha de spin. MCS foi desenhada por um aspirador de água através CA filtro, então Cambridge filtro (filtro amarelo) e passou por uma armadilha de nitrogênio líquido para remover H ₂ O. Os produtos fase gasosa finalmente fui para girar armadilha e borbulhar na solução armadilha spin. Antioxidante de plantas foi colocado entre dois pedaços de acetato de filtros convencionais (alargada em círculo A) ligado ao cigarro para varrer os radicais livres no MCS.

Figura 2. A estimativa quantitativa para a concentração aduto-spin trapping em benzeno requer subtrair um sinal de fundo largo da integração primeiral espectro. Os parâmetros hiperfinos divisão para o aduto-spin trapping é um _H = 1,95 G, um _N = 13.7G.

Figura 3. Passando por LN2 armadilha melhora substancialmente a qualidade dos sinais ESR obtidos por spin trapping de MCS.

Figura 4. Efeito de antioxidantes naturais sobre a concentração de radicais livres no MCS. As intensidades de sinal são: controle - 100%, pycnogenol - 55%, extrato de semente de uva - 12%, o licopeno - 10%.

Discussão

A estimativa confiável do efeito de diferentes radicais livres catadores no fumo do tabaco requer uma técnica reprodutível para a detecção quantitativa de radicais livres. Anteriormente ^1, demonstrou-se que pequenos volumes de soluções de maior concentração de spin armadilha em solventes não-polares são mais eficazes na captura de radicais livres do fumo do tabaco. A fumaça do cigarro contém sempre vapor de água provenientes da combustão de compostos orgânicos e da umidade residual do tabaco, que pode acabar no solvente trapping. Esta mistura de água na solução armadilha de spin PBN diminui substancialmente o tempo de vida do adutos armadilhas de spin ea intensidade de seus sinais ESR. Removendo a umidade por simples MCS passando através de um tubo em forma de U resfriado com nitrogênio líquido melhoraram consideravelmente a qualidade de espectros de ESR em nossos experimentos, apesar de alguma fração de fase gasosa radicais pode ser também presa na superfície congelada.

Usando tsua técnica, comparamos a eficiência relativa de diferentes radical-limpeza compostos naturais introduzidos filtros de cigarro. Descobrimos que o licopeno e extrato de semente de uva imediatamente após a incorporação em filtros de cigarro são capazes de limpar até 90% de radicais livres a partir do MSC fase gasosa. Alta capacidade de limpeza, tais fileiras essas baratas disponíveis compostos naturais entre os mais eficientes reportados livre protetores radical como a hemoglobina e shikonine ^8,14. No entanto, em nossos filtros de cigarro carregado com experimentos estudados antioxidantes naturais perdeu uma parte considerável de sua capacidade de limpeza depois de uma semana de armazenamento em temperatura ambiente. Resolver este problema pode estimular a futura aplicação de licopeno e extrato de semente de uva em filtros de cigarro comercial.