Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Resumo

Nós desenvolvemos novas ferramentas de laboratório e protocolos para aquisição de imagens intravital do timo. Nossa técnica deve ajudar na identificação de "nichos" dentro do timo, onde o desenvolvimento de células T ocorre.

Resumo

Dois fótons-Microscopia (TPM) fornece a aquisição de imagens em áreas mais profundas dentro tecidos e órgãos. Em combinação com o desenvolvimento de ferramentas estereotáxica novo e procedimentos cirúrgicos, TPM se torna uma poderosa técnica para identificar "nichos" dentro de órgãos e ao documento celular "comportamentos" de animais vivos. Enquanto imagem intravital fornece informações que melhor se assemelha ao comportamento real celulares dentro do órgão, é tanto mais trabalhoso e tecnicamente exigentes em termos de equipamentos necessários / procedimentos alternativos que ex aquisição de imagem in vivo. Assim, nós descrevemos um procedimento cirúrgico e da novela titular do órgão "estereotaxia" que nos permite acompanhar os movimentos de Foxp3 + células dentro do timo.

Foxp3 é o regulador mestre para a geração de células T reguladoras (Tregs). Além disso, essas células podem ser classificadas de acordo com sua origem: ou seja. timo diferenciadas Tregs são chamados de "ocorrência natural Tregs" (nTregs), como opposed para perifericamente convertida Tregs (pTregs). Apesar de quantidade significativa de pesquisas tem sido relatado na literatura sobre o fenótipo e fisiologia destas células T, muito pouco se sabe sobre suas interações em vivo com outras células. Esta deficiência pode ser devido à ausência de técnicas que permitissem tais observações. O protocolo descrito neste artigo fornece um remédio para esta situação.

Nosso protocolo consiste na utilização de camundongos nude que falta um timo endógena, uma vez que têm uma mutação pontual na seqüência do DNA que compromete a diferenciação de algumas células epiteliais, incluindo células epiteliais tímicas. Camundongos nude foram gama-irradiados e reconstituídos com abobrinhas óssea (MO) de camundongos ^{GFP / gfp} Foxp3-KI. Depois BM recuperação (seis semanas), cada animal recebeu transplante embrionário timo dentro da cápsula renal. Após a aceitação do timo (6 semanas), os animais foram anestesiados, o rim que contém otimo transplantado foi exposto, fixo em nosso titular do órgão, e mantidos sob condições fisiológicas para in vivo de imagens por TPM. Temos vindo a utilizar essa abordagem para estudar a influência de drogas na geração de células T reguladoras.

Protocolo

1. Preparação de animais

Notas importantes: suspensões de células do timo BM e transplantes foram realizados em condições assépticas. As suspensões foram preparadas BM no interior do capuz da nossa sala de cultura de células, enquanto que o transplante de timo foi realizada na sala cirúrgica localizada dentro de nossas instalações para animais. A fim de manter e garantir essas condições assépticas, que não foram autorizados a gravar nosso vídeo nesses lugares. No entanto, todos os materiais cirúrgicos foram autoclavados e da bancada cirúrgica foi previamente limpa com Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc.) e etanol 70%. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) e eles estavam de acordo com a Federação das Associações Laboratório Europeu de Ciência Animal (FELASA) directivas. O número de identificação de aprovação é AO10/2010. Todos os experimentos foram imagem de procedimentos terminal e os animais foram sacrificados imediatamente após o fim da imagemaquisição.

O procedimento detalhado é o seguinte:

1. Irradiar (com um irradiador γ) 8 semanas de idade camundongos Nude com 900 rads para destruir os precursores endógenos hematopoiéticas dentro da medula óssea (BM). Após a irradiação, o retorno dos animais ao seu gaiolas até que você prepare as células do doador BM para injecção intravenosa e reconstituição BM ainda mais. Esta transferência foi realizada BM 1 h após a irradiação.
2. Separar os animais dadores BM. Tíbias e fêmures de membros posteriores de um animal são geralmente suficientes para reconstituir até 3 animais destinatário. Após eutanásia com CO _2, retire a membros posteriores e, em seguida, retire a pele e os músculos dos ossos.
3. Corte a extremidade fechada de cada osso e lave-o com PBS (ou RPMI) ou esmagá-los todos em um almofariz, usando um pilão, com 2 ml de PBS (ou RPMI) para remover o BM.
4. Romper a estrutura BM em uma suspensão de uma única célula por repetições de vigorosa aspiração using uma pipeta P1000. Alternativamente, você também pode passar o BM através de uma agulha da seringa 21G várias vezes. Centrifugação (400g, 5 min, RT), re-suspender as células em PBS, e injectar por via intravenosa em sua nude-irradiados destinatários. Em nossos experimentos usamos BM de Foxp3-KI ^{gfp / mice gfp,} onde todas as células T reguladoras (Tregs) vai expressar GFP ^1.
5. Aceitação da BM doador ocorre nos primeiros dias após a transferência, uma vez que não BM-reconstituída animais não podem sobreviver mais de 14 dias. No entanto, deve-se esperar por 4 a 6 semanas para permitir a recuperação completa de todos os compartimentos BM. Bactrim (Roche) foi adicionado à água (2 mg / ml) durante a primeira semana após a irradiação para diminuir o risco de infecções bacterianas.
6. Embrionárias timo transplante já foi descrito ^2. Brevemente, começar a criação de pares de camundongos isogênicos e verifique se há entupimento (evidência de coito) todos os dias. Fêmeas em separado conectado e CO _{2-sacrificá-los} no dia 15 de pregnAncy (observação de plug é dia 1 de gravidez). Remoção dos embriões eo timo. Coloque o timo embrionárias no frio PBS até a transferência.
7. Para realizar o transplante timo, anestesiar BM-destinatário camundongos Nude com cetamina (120 mg / g de peso do rato) / xilazina (16 mg / g de peso do rato) e mantê-los em cima de uma almofada de aquecimento a 37 ° C até se obter inconsciente.
8. Cirurgicamente expor o rim para realizar o transplante do timo. Primeiro esfregue a pele com ChloraPrep (CareFusion Inc.) e etanol 70%. Então, faça um corte um centímetro na pele da parte do corpo volta-lateral do animal, 2 mm abaixo da última costela torácica.
9. Corte a cavidade peritoneal e puxe o rim desta cavidade. Faça um pequeno corte superficial na cápsula renal com uma lâmina de bisturi. Utilizando uma pinça com uma ponta muito fina fazer uma bolsa debaixo da cápsula renal do rato do destinatário e adicione até 4 lobos do timo nessa bolsa.
10. Coloque o b renal ack ao seu lugar, sutura da cavidade peritoneal com um ou dois pontos, e feche a pele do rato usando o método de sutura mesmo. Alternativamente, suturas pode ser feito usando cola cirúrgica.
11. Injetam analgésicos (butorfanol a 5 mg / kg) por via subcutânea imediatamente após o término da operação para evitar a dor dos animais e manter os animais em uma almofada de aquecimento até que começar a se recuperar da anestesia. Os ratos são gaiolas individualmente para os 3 primeiros dias após o transplante para prevenir companheiros de gaiola de remover os pontos. Remove pontos após 1 semana.
12. Camundongos nude não têm células T. Portanto, você pode avaliar a aceitação do enxerto timo, monitorando a percentagem de CD4 + ou CD8 + T no sangue. Uma vez por semana, duas semanas após o transplante timo, sangrar os animais e manchar o sangue com anti-CD4 e anti-CD8 anticorpos monoclonais (MAbs). Quando o CD4: CD8 é de aproximadamente 2:1, o timo transplantado é totalmente funcional (Figura 1).

"> 2. Intravital aquisição de imagem

Prepare todos os materiais que você vai precisar de antecedência e colocá-los de lado.

1. Anestesiar animais com cetamina / xilazina (mesmas doses descritas no item 1.5) e colocá-los em cima de uma almofada de aquecimento a 37 ° C. Injetar 100 ml de Rodamina B isotiocianato-Dextran (20 mg / ml em PBS) por via intravenosa para permitir a visualização futuro do fluxo sanguíneo.
2. Expor o rim transplantado que contém o timo de acordo com o protocolo previamente descrito no item 1.6.
3. Para evitar que o rim de volta à sua posição original, feche as laterais da incisão na pele com pontos.
4. Coloque um pedaço de algodão embebido PBS-na parte superior do órgão para mantê-lo úmido.
5. Coloque a almofada de aquecimento em cima do palco titular animal (Figura 2A).
6. Colocar o animal em cima da almofada de aquecimento no porta-animal, até de órgãos (Figura 2B).
7. Pitada o órgão em ambos os lados com uma braçadeira made de papel de alumínio fino (Figura 2C).
8. Feche o suporte do animal e colocar a sonda aquecedor superior o mais próximo possível de seu tecido (Figura 2D). Esta sonda aquecedor constantemente mede a temperatura de órgãos e envia essa informação para o aquecedor para ajustar a corrente elétrica, mantendo-o a 37 ° C.
9. Remover o algodão embebido PBS e adicionar ponto de fusão baixo agarose (2% em PBS) a 30 ° C no topo de sua preparação.
10. Cobrir toda a preparação com o aquecedor superior (Figura 2E). Na abertura deste aquecedor há uma lamela isolar a agarose do objetivo (Figura 2F). Monitorar a anestesia do mouse e injetar um impulso meia dose a cada 40 min. Após a aquisição da imagem, eutanásia do animal com CO _2.

Nota: imagens do clipe de papel-alumínio e do aquecedor superior são apresentados na Figura 3.

3. Dois fótons de aquisição de imagem

Usamos uma posição vertical "Prairie Ultima XY" microscópio de dois fótons. Nosso sistema é equipado com uma Ti: Sapphire laser, quatro PMTs superior para simultânea de até 4 aquisições do canal e um 20x objetivo imersão em água.

1. Ligue a Ti: Sapphire laser eo sistema de microscópio todo.
2. Adicionar espelhos dicróicos e conjuntos de filtros de acordo com os comprimentos de onda desejados. No nosso caso, usamos um titular Olympus-BX2 Chroma contendo um espelho nm 565 dicróicas, um filtro 525/50 nm (para Foxp3 GFP-sinal), e um filtro 595/50 nm (para Dextran-rodamina-B do sinal dentro dos vasos sanguíneos ). A faixa de comprimento de onda do laser utilizado foi entre 880-900 nm.
3. Adicione o detentor de animais ao microscópio, conectar e ligar todos os aquecedores, adicione água sobre a abertura do aquecedor superior, inferior cuidadosamente o objectivo para a água, e se concentrar em um vaso ou algum GFP-Tregs.
4. Com o microscópio x, y, z controle externo, de forma rápida pesquisa no tecido para localizar uma região de interesse.
5. Ajustar o ganho no PMTs para otimizar a separação de cores e minimizar a quantidade de laser necessária para conseguir sinal suficiente sobre o fundo. Tente usar a quantidade mínima de laser para evitar a foto-dano do seu tecido.
6. Uma vez que a região de interesse está localizado, comece lapso de tempo de imagem. No nosso caso, uma 5D típico (x, y, z, t, e cor) protocolo de aquisição consiste em adquirir imagens sequenciais de um volume de tecido 50 mm profundidade, dividido em 4,0 mM z-passos, x e y comprimento de 140 mM cada um. Cada volume tem cerca de 30 segundos a serem adquiridos. Portanto, 60 aquisições irão realizar cerca de 30 min de aquisição de imagem.
7. Transferir os dados para o servidor institucional e uso ImageJ, Imaris, ou software Volocity para executar multi-dimensional de processamento e monitoramento celular.

4. Resultados representante

g1.jpg "/>
Figura 1. . Embrionárias aceitação timo e função BM Após se recuperar, timo embrionárias foram transplantadas para animais BM reconstituída; duas semanas após o transplante de timo, esses ratos foram sangrados uma vez por semana para monitorar o percentual de subtipos de células T através da coloração com anti-CD4 e anti-CD8 MAbs. Consideramos o timo foi aceito com sucesso em animais com um CD4: CD8 em torno 1.5-2.0:1 (A). Para confirmar a sua funcionalidade, sacrificamos alguns animais timo-transplantados e comparou o percentual de diferentes subpopulações timócito com camundongos WT (B). As porcentagens de dupla negativa (DN; CD4 ^- CD8 ^- timócitos) subpopulações (por coloração com anticorpos anti-CD25 e anti-CD44 MAbs), duplo-positivos (DP; CD4 ⁺ CD8 ⁺ timócitos) e single-positivo (SP) CD4 ⁺ ou CD8 ⁺ timócitos foram semelhantes entre esses animais.

ig2.jpg "/>
Figura 2. Conjunto do suporte de animais. Depois profundamente anestesiado, o animal é colocado em cima de uma almofada de aquecimento, anteriormente montado em cima do palco titular animal (A). O rim transplantado que contém o timo é voltada para cima (B). Um prendedor de folhas de alumínio delicadamente aperta o rim inteiro (C) para mantê-lo no lugar. Fig. 1C inserir mostra em detalhes do grampo. A parte superior do porta-animal é posto em prática (D). O algodão embebido PBS é removido do topo do órgão, substituído pelo quentes ponto de fusão baixo agarose, eo aquecedor superior é adicionado (E). Finalmente, toda a assembléia é transferido para o microscópio, aqui representado pelo objetivo (F).

Figura 3. Detalhes das peças titular. Essas imagens mostram o prendedor de folhas de alumínio (A) segurando o rim (B). Note também a região onde o timo transplantado é localizado. Esta aproximadamente indica a regiãopara cortar a cápsula do timo e fazer o bolso para colocar o timo embrionárias. A lamela aquecedor superior (C) foi fixado com cola de silicone para a sua parte inferior (D).

Movie 1. Intravital imagem de timócitos + Foxp3-GFP dentro do timo, onde os níveis fisiológicos de oxigenação e temperatura (37 ° C) foram mantidos durante todo o processo. Observe o fluxo sanguíneo e do movimento de Tregs. Estas velocidades podem ser medido e comparado com os dados publicados. Clique aqui para ver o filme.

Filme 2. Intravital imagem de Tregs no interior de um timo onde as imagens foram adquiridas menos 30 ° C. Note a ausência de movimento e a forma redonda das células, apesar da manutenção do fluxo sanguíneo. Clique aqui para ver o filme.

Discussão

Neste trabalho, demonstrou os procedimentos para dois fótons de imagem de timócitos dentro de um animal vivo. Nós também descreveu alguns parâmetros que se deve controlar cuidadosamente, como a continuação do fluxo sanguíneo e à manutenção da temperatura do órgão durante os procedimentos de imagem. No entanto, apesar dos esforços o cuidado de manter o órgão estável, artefatos de movimento, como "órgão drifting" pode ocorrer. Correção de imagem posterior pode ser realizado através do desenvolvimento de algoritmos projetados especificamente para esta finalidade. Análise de imagem mais também poderia ser a fonte do desenvolvimento de novos protocolos que visa a minimizar os erros.

O timo é o órgão onde todas as células T são produzidos e, portanto, é o órgão onde imunologistas interessados ​​em compreender a geração de γδ, CD4 ou células T CD8 irá centrar a sua atenção. A maioria dos estudos sobre as células T são baseadas em diferenças de números e / ou estabilidade destas cells após diferentes in vitro / in vivo manipulações. No entanto, somente após a visualização in vivo pudemos observar a interação entre as células do sistema imune envolvidos na manutenção da homeostase ^3-7. Portanto, a observação em vivo dos timócitos é provavelmente uma das informações mais importantes em falta para compreender melhor a biologia das células T. Intravital TPM fornece um retrato detalhado dos movimentos de células T e as interações e demonstramos aqui como ele pode ser usado para estudos detalhados de timócito. No entanto, cada técnica tem suas limitações. Embora a aquisição de imagens intravital é o sistema mais acurado para refletir o comportamento de células dentro do corpo, também é verdade que a aquisição da imagem explantado de órgãos é menos trabalhoso e tem sido utilizado para coletar informações importantes sobre o sistema imunológico ^8,9. Além disso, não se pode negar métodos de imagem intravital requerem cirurgia para expor os tecidos e vasos sanguíneos em animais anestesiados,que por si só pode causar uma alteração no órgão toda a fisiologia ^10. No entanto, existem métodos não-invasiva que abolir a artefatos causados ​​pelo procedimento cirúrgico ¹¹ e novos métodos estão sendo desenvolvidos que melhor se preparar com antecedência os animais a serem utilizados ^12. Portanto, novos procedimentos cirúrgicos e portagens irá minimizar ou ignorar as limitações reais de aquisição de imagens intravital e se tornar mais e mais acessível à comunidade científica.

Nós demonstramos que o método que descrevemos é viável e que relata todas as manipulações in vivo sistêmica, a administração dessas drogas, que temos usado. Assim, sugerimos o uso deste método em conjunto com técnicas ex vivo já disponíveis, a fim de complementar e reforçar mais estudos sobre o desenvolvimento timócitos.

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Name	Company	Catalog Number	Comments
Rodamina B ishothiocyanate-Dextran	Sigma-Aldrich	R9379	preparar estoque em 20 mg / ml
Microscópio de dois fótons	Prairie Technologies Inc.	Prairie Ultima XY
Ti: Sapphire a laser	Coerente, Inc.	Chameleon Família Ultra
20x/1.00 objetiva de imersão NA	Olympus Inc.	XLUMPLFLN 20XW
Titular (Filtros / Dichroic)	Chroma Technology Corp	91018 BX2 (U-MF2)
525 nm/50 filtro	Chroma Technology Corp	ET525/50m
595 nm/50 filtro	Chroma Technology Corp	ET595/50m
565 nm dichroic	Chroma Technology Corp	565dcxr
Imaris software	Bitplane AG Inc.	Imaris
Volocity	PerkinElmer Inc.	Volocity
ImageJ	NIH, EUA	ImageJ