Cirurgia estereotáxica de roedores e animais Melhorias Resultado do Bem-Estar de Neurociência Comportamental

Resumo

Cirurgia estereotáxica em roedores permite a administração alvo de drogas ou estimulação elétrica e gravações em despertos, comportando-se animais. Neste vídeo de apresentação iremos demonstrar recentes refinamentos processuais para este procedimento de longa data que a taxa de sobrevivência melhorou com sucesso e perda de peso reduzido pós-cirúrgico.

Resumo

Cirurgia estereotáxica para implantação de cânulas em regiões específicas do cérebro tem por muitas décadas foi uma técnica muito sucesso experimental para investigar os efeitos do neurotransmissor localmente manipulados e vias de sinalização em vigília, os animais se comportando. Além disso, a implantação estereotáxica de eletrodos para a estimulação eletrofisiológica e estudos de gravação tem sido fundamental para a nossa compreensão atual de neuroplasticidade e redes cerebrais no comportamento dos animais. Conhecimento cada vez maior sobre a otimização de técnicas cirúrgicas em roedores ^1-4, conscientização pública sobre questões de bem-estar animal e legislação rigorosa (por exemplo, de 2010 a Directiva da União Europeia sobre o uso de animais de laboratório ⁵⁾ nos levou a aperfeiçoar esses procedimentos cirúrgicos, particularmente com respeito a implementação de novos procedimentos para a suplementação de oxigênio e da monitorização contínua da oxigenação do sangue e os níveis de frequência cardíaca durante a cirurgia, bem comointrodução de um protocolo padronizado para atendimento pós-cirúrgico. Nossas observações indicam que essas modificações resultaram em uma taxa de aumento da sobrevida e uma melhora na condição geral dos animais após a cirurgia (por exemplo, perda de peso menor e um animal mais ativo). Esta apresentação de vídeo vai mostrar os procedimentos gerais envolvidos neste tipo de cirurgia estereotáxica com especial atenção para o nosso várias modificações. Vamos ilustrar esses procedimentos cirúrgicos em ratos, mas também é possível realizar este tipo de cirurgia em ratos ou outros animais de laboratório pequenos usando adaptadores especiais para o aparelho estereotáxico ^6.

Protocolo

Nota: técnicas de anti-séptico deve ser empregado durante todo o procedimento. Todos os instrumentos e materiais (cotonetes, gazes, etc) que serão utilizados durante a cirurgia deve ser esterilizado em autoclave. A máscara cirúrgica, gorro cabelo e luvas estéreis devem ser usados. A área de trabalho e do aparelho estereotáxico deve ser cuidadosamente limpos e desinfetados com uma solução de etanol 70%.

1. Procedimentos pré-cirúrgicos

1. Configurar o aparelho estereotáxico e todos os materiais necessários. Pré-aquecer a almofada de aquecimento.
2. Coloque a cânula em seu apoio e verificar se ele é reto.
3. Ligue o sistema de gás - mistura de ar ambiente e oxigênio (30-35% do fluxo total deve ser de oxigênio).
4. Pesar o rato e administrar o anestésico. Estamos usando uma mistura de cetamina (37,5 mg / kg) e dexmedetomidina (0,25 mg / kg) administrado por via subcutânea. Para protocolos de anestesia diferente, consulte Flecknell ⁴ e Hellebrekers et al. ^7.
5. Após o rato perdeu a consciência, raspar a área que vai da cabeça ouvidos apenas entre os olhos com um barbeador elétrico.
6. Coloque o rato sobre a almofada de aquecimento, com o nariz na frente do tubo de ar. Use um oxímetro para garantir que o rato tem um nível de oxigenação adequada do sangue (não deve cair <90%). Por favor, siga as instruções do fabricante para a utilização correcta do equipamento.
7. Aplicar creme para os olhos (Duratears Z, Alcon) em ambas as córneas para evitar a desidratação.
8. Verificar os reflexos do rato (cauda reflexo ou dedo do pé pinch-reflex, como demonstrado no Walantus et al. ⁸⁾ para garantir que ele seja adequadamente anestesiados. Se o rato continua a mostrar reflexos fortes, a suplementação de anestesia pode ser necessária.
9. Se nenhum reflexo toe pinch é mostrado, coloque o rato no aparelho estereotáxico, ajustar as barras de ouvido para que ele mostra a leitura igual em ambos os lados, e coloque novamente o tubo de ar na frente do animalfixando-a com a barra de nariz. Verifique novamente se o rato mostra um nível de oxigenação do sangue de 90% ou mais. Se não, ajuste ou a tubulação, aproximando-a do nariz, ou aumentar o fluxo de oxigênio. Monitorar o nível de oxigenação do sangue e da freqüência cardíaca durante a cirurgia.
10. Monitorar continuamente a temperatura do rato com um termômetro retal (preferencialmente ligado a uma almofada de aquecimento) e registre os valores no início e no final da cirurgia. Ajuste a almofada de aquecimento ou usar um cobertor para manter uma temperatura corporal de 37,5 a 38,5 ° C.

2. Cirurgia

1. Injetar o analgésico. Estamos usando uma administração peri-operatória única de carprofeno (4,0-5,0 mg / kg, por via subcutânea). Para diferentes protocolos analgésicos, ver Hellebrekers et al. ^7.
2. Limpar a área raspada de tele pele do centro para o perímetro cabelos três vezes com um desinfectante (por exemplo, clorexidina 0,5%) e localmente injetar uma mistura de lidocaína (20 mg / ml) e adrenalina (5 mg / ml) para anestesia local e vasoconstrição (para evitar sangramento excessivo).
3. Faça uma incisão ântero-posterior de cerca de 2,5 cm na linha média do couro cabeludo, passando de entre os olhos até a parte de trás das orelhas. Use grampos 06/04 bulldog para beliscar fora da pele e manter a incisão aberta. Remover qualquer tecido conjuntivo com uma espátula e / ou cotonetes e limpe a área para expor a superfície do crânio.
4. Verifique se a cabeça é o nível: Primeiro, encontre Lambda e coloque a cânula guia exatamente sobre esse local, tocando o crânio. Registro a coordenada dorso-ventral. Em seguida, coloque a cânula guia exatamente sobre bregma, tocando o crânio, e registrar sua coordenada dorso-ventral. Estas duas coordenadas devem ser idênticos. Se a diferença for> 0,3 mm, ajuste a barra de nariz para corrigir isso.
5. Make dois pequenos furos para a fixação dos parafusos de caveira usando uma broca de mão esterilizados (um milímetro de aproximadamente 5 para o local anterior cânula em um dos hemisférios e os outros 5 mm posterior ao local da cânula no hemisfério contralateral). Coloque dois parafusos estéril nestes buracos até que eles estão bem ancoradas, sem estar completamente inserida dentro do crânio.
6. Com a cânula guia colocado exatamente no bregma, gravar as coordenadas ântero-posterior e lateral. O local correto da guia colocação cânula para cada região do cérebro pode ser calculado somando ou subtraindo bregma, com a ajuda de um atlas estereotáxico ^9-11.
7. Posição da cânula guia no seu local correto, ligeiramente tocando o crânio. Registro a coordenada dorso-ventral. Para a colocação de cânula bilateral, encontrar próxima do local da cânula no outro hemisfério, e novamente recorde a coordenada dorso-ventral. Ambas as coordenadas devem ser idênticos (ou diferir <0,3 mm).
8. Marque os locais cânula no crânio com um lápis estéril e, com o perfurador de mão, fazer os furos rebarba, verificar o tamanho ea localização correta com a ajuda da cânula guia. Uma vez que os buracos são feitos, use uma agulha estéril para perfurar o meninges suavemente para permitir a inserção desobstruída da cânula.
9. Coloque a cânula no orifício primeiro e abaixá-lo com cuidado até que ele atinja a cota final ventral. Prepare o cimento dental e generosamente aplicá-la ao redor da cânula e um ou dois parafusos para fixar a cânula. Aguarde até que o cimento secar por completo. Depois, remova cuidadosamente o apoio cânula girando para cima dorso-ventral bar.
10. Coloque a cânula segundo para o apoio e vá até o local da cânula no outro hemisfério. Coloque a cânula no orifício e repita o passo anterior. Cobrir os parafusos e uma grande superfície das cânulas com o cimento, e antes que o cimento secar, retirar qualquer excesso da pele.
11. Injetar quente (~ 37 ° C) solução salina estéril (~ 10 ml / kg, sc) para garantir a reidratação.
12. Depois que o cimento esteja completamente seca, retire o apoio cânula e coloque um alfinete estéril em cada cânula para evitar obstrução.
13. Limpar a área da ferida com solução salina estéril e sutura da frente e as costas da ferida.
14. Remover o animal do aparelho estereotáxico, substituindo a tubulação de gás na frente de seu nariz. Continuar a acompanhar o nível de saturação de oxigênio e temperatura corporal.
15. Se um anestésico injetável com dexmedetomidina é usada, injetam sua atipamezol antagonista (0,25 mg / kg, sc) e aguarde até que o animal acorda (aproximadamente 5 minutos).
16. Coloque o rato em uma gaiola de recuperação. Para evitar a hipotermia, coloque a gaiola em uma incubadora a 28 ° C ou em uma almofada de aquecimento em um lugar onde você pode observar o animal por pelo menos uma hora, antes de retornar à sala de viveiro.

3. Cuidados pós-cirúrgicos

1. Durante os primeiros 4 dias após a cirurgia, monitor de recuperação do rato, mantendo os registros diários de peso e outras observações a respeito da condição do animal em laboratório ou diários de bordo "diários bem-estar animal".
2. Animais que mostram sinais evidentes de infecção doença, do ferimento, perda de peso corporal ou outros sinais de redução de bem-estar devem ser submetidos a cuidados especiais: por exemplo, uma dose extra de analgésicos para minimizar a dor pós-operatória, uma mistura de alimentos em pó e água além de ração padrão para estimular o apetite do rato, e / ou uma injecção subcutânea de solução salina para apoiar a reidratação.
3. Se o rato não mostra qualquer melhora após essas intervenções, ou a perda de peso corporal é> 15% (em comparação à cirurgia pré-peso), o sacrifício do animal com uma overdose de anestésico (humana ponto final).
4. Ratos normalmente precisam de recuperar, pelo menos, sete dias antes do início dos experimentos comportamentais.

4. Resultados representante

> jove_content "Para determinar se a várias modificações ao nosso procedimento cirúrgico, particularmente com relação à suplementação de oxigênio e do monitoramento contínuo dos níveis sanguíneos de oxigenação, freqüência cardíaca e temperatura corporal, maior a sobrevida do animal e melhorou sua condição geral após a cirurgia, foram comparados os não-sobrevivência taxa de 20 grupos de animais (composto de 20 ratos cada) que foram submetidos à cirurgia depois que implementou essas modificações com a taxa de sobrevivência não de 24 coortes (20 ratos cada) operado com o protocolo padrão. Como é mostrado na Figura 1a , a taxa de sobrevivência não foi significativamente reduzida na amostra de coortes que foi operado com o protocolo modificado (P <0,05; Mann-Whitney, duas caudas). Além disso, como é mostrado na Figura 1b, perda de peso pós-cirúrgica de ratos operados com o protocolo modificado também foi significativamente reduzida quando comparada com a de ratos operados com o procedimento normal (dia pós-operatório 1: P <0,05; dia pós-operatório 2: P <0,01; dia pós-operatório 3: P = 0,17; Student t-tests).

Figura 1. Efeito de modificações cirúrgicas sobre a não-sobrevivência taxa e pós-cirúrgico de perda de peso. (A.) taxa de não-sobrevivência de ratos operados com o protocolo modificado em comparação com a de ratos operados com o protocolo padrão. A taxa de não-sobrevivência (média ± interquartil faixas) foi calculado como o percentual de ratos, por coorte de 20 ratos, que não sobreviveu a cirurgia. * P <0,05, Mann-Whitney bicaudal (n = 20 coortes para o protocolo modificado e 24 coortes para o protocolo padrão). (B) A perda de peso (média ± EPM em percentagem do peso pré-cirurgia), durante o primeiro (Pod1), segundo (POD2) e terceira (POD3) dia pós-operatório. * P <0,05, ** P <0,01, teste t de Student (n = 60 por grupo).

Discussão

O principal objectivo desta apresentação de vídeo é familiarizar os neurocientistas comportamentais com os princípios básicos da cirurgia estereotáxica. Pesquisadores que já estão realizando a cirurgia estereotáxica pode também beneficiar deste vídeo e considerar alguns dos refinamentos processuais para o uso em seu próprio laboratório. Um conhecimento cada vez maior sobre a otimização de técnicas cirúrgicas ^1-3, o desenvolvimento de novos anestésicos e analgésicos para uso em medicina hum...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia
Álcool a 70%	VWR
Antisedan (atipamezole)	Orion
Sulfato de atropina 0,5	Pharmachemie BV
Bulldog pinça hemostática	Aesculap
Cânulas	Component Supply Co.
Clorexidina 0,5%	AppepPharma
Limpeza em pó	Alconox
Varas de algodão	Hartmann BV
Dexdomitor (dexmedetomidina)	Orion
Broca	Dremel 8000
Duratears Z	Alcon
Durogrip Naaldvoerder conversar 130 milímetros	Aesculap
Durotip Fijne schaar ret.sp / st 110 milímetros	Aesculap
Gaze	Medicomp (5x5)
Almofada de aquecimento	Harvard Apparatus
Pinos de insetos (estiletes)	Entosphinx (Czech Republik)
Ketamina 10% (ketamina)	Alfasan
Micro-Halsted ponta reta	Aesculap vet-
Molinea	Hartmann BV
NaCl 0,9%	Baxter
Agulhas (25G)	Terumo
Oxímetro	Edan Instruments, Inc.
Pentobarbital	Farmácia da UMCG
Rimadyl	Pfizer
Lâmina de bisturi n º 23	Swann Morton
NR Scalpelholder. 4 133 milímetros	Aesculap
Chave de fenda	Loja Hardware convencionais
Simplex rápida (cimento dental)	Kemdent
Parafusos crânio	Component Supply Co.
Espátula	VWR
Spongestan especiais	Johnson & Johnson
Stereotacts	Kopf Instruments
Pinça cirúrgica 100 milímetros	Aesculap
Material de sutura Safil 5 / 0	Aesculap
Seringa de 10 ml	Omnifix
Seringa de 1ml	Terumo
5ml da seringa	Omnifix
Xilocaína (lidocaína / adrenalina)	Astra Zeneca