Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

Resumo

Nós fornecer um protocolo para a cultura de neurónios do hipocampo altamente purificado a partir de cérebros de rato pré-natal, sem a utilização de uma camada de células alimentador glial.

Resumo

As culturas primárias de rato e murina neurónios do hipocampo são amplamente utilizados para revelar os mecanismos celulares em neurobiologia. Com o isolamento e crescente neurónios individuais, os pesquisadores são capazes de analisar as propriedades relacionadas com o tráfico celular, a estrutura celular e localização de proteínas individuais usando uma variedade de técnicas bioquímicas. Os resultados de tais experiências são fundamentais para testar as teorias que abordam a base neural da memória e aprendizagem. No entanto, a partir de resultados inequívocos estas formas de experiências são baseadas na capacidade de crescer culturas neuronais com a contaminação mínima por outros tipos de células cerebrais. Neste protocolo, usamos meios específicos projetados para o crescimento dos neurônios e dissecção cuidadosa do tecido hipocampal embrionário para otimizar o crescimento de neurônios saudáveis, minimizando os tipos de células contaminantes (astrócitos, por exemplo). Tecido embrionário de rato do hipocampo pode ser mais difícil de isolar do que o tecido roedor semelhante, devido ao tamanho da amostra para o dissection. Mostramos técnicas de dissecação detalhadas de hipocampo de ratos filhotes embrionárias dia 19 (E19). Uma vez que o tecido do hipocampo é isolado, a dissociação suave de células neuronais é conseguido com uma concentração diluída de tripsina e ruptura mecânica concebido para separar células de tecido conjuntivo, proporcionando mínimo de danos para as células individuais. Uma descrição detalhada de como preparar pipetas para ser utilizado na ruptura é incluído. Densidades de revestimento ideais são fornecidas de imuno-fluorescência protocolos para maximizar a cultura de células de sucesso. O protocolo fornece uma técnica rápida (cerca de 2 horas) e eficiente para a cultura de células neuronais do hipocampo do rato a partir de tecido.

Protocolo

1. Set-up antes da colheita

1. Para gerar filhotes de pré-natal para a colheita neurônio, agendar cruzamento entre camundongos adultos de 19 dias antes do dia de isolamento do neurônio. (C57BL / 6 idades de 2-8 meses, foram usados ​​em acasalamentos para efeitos de desenvolver este protocolo). Acasalamento bem sucedida pode ser confirmado por detecção de um rolhão vaginal na confirmação palpitação, fêmea ou visual da gravidez.
2. O dia antes do isolamento do neurônio:
   1. Para aplicações de imunofluorescência, lamelas de vidro em revestimento de uma placa de 24 cavidades com uma camada leve de 03:01 Collagen 1, cauda de rato: poli-D-Lisina solução.
   2. Para aplicações de cultura de células, o revestimento de tamanho apropriado do tecido utensílios de plástico de cultura com uma camada leve de 3:1 Collagen 1, cauda de rato: poli-D-Lisina solução.
3. Descanse as placas descobertos em uma capa de cultura de tecidos sob a luz UV durante a noite.
4. Lavar as placas com Hank estéril de Solução Salina Equilíbrio (HBSS) antesde usar. Placas revestidas podem ser preenchidos com HBSS e armazenado até uma semana a 4 ° C no escuro.

2. Colheita de Tecidos

1. A esterilidade é sempre um fator quando crescer culturas celulares primárias e, como tal, o maior cuidado deve ser exercido para garantir o ambiente mais estéril possível. Com muita atenção à técnica estéril, dissecção inicial e colheita de tecido neural para este protocolo pode ser concluído fora de uma câmara de fluxo laminar com um risco mínimo de contaminação. Após a colheita inicial, todas as etapas subsequentes devem ser realizados sob condições estéreis máximos dentro de uma capa classificado para cultura de células.
2. Euthanize um rato grávida de aproximadamente 19 dias pós-fertilização por decapitação. A utilização de anestesia a eutanásia a fêmea grávida não é recomendada como anestesia é conhecido por causar a morte das células do cérebro (Stratmann, et al., 2010). Usando estéreis tesoura de dissecção e pinças, criar uma abertura no lado ventral domouse para revelar completamente cavidade do corpo. Os instrumentos podem ser esterilizados com álcool e uma chama aberta.
3. Filhotes de pré-natal será localizado para a parte posterior da cavidade do rato corpo e devem ser facilmente visíveis no útero. Com uma pinça estéril, autoclavada, abra o útero e remover filhotes. Decapitar filhotes com novas tesouras estéreis e cabeça no lugar removido gaze estéril sob um microscópio de dissecação. Estéreis, instrumentos autoclavados pode ser chama limpa utilizando álcool e uma chama aberta antes e durante a utilização.
4. Com uma tesoura estéreis ou crânio, bisturi aberto de filhote de trás do pescoço até o nariz. Este procedimento pode normalmente ser completado com a inserção uma ponta da tesoura dentro do forame vertebral e, em seguida, proceder anteriormente. Retire cuidadosamente o cérebro inteiro com uma pinça. Coloque o cérebro em gaze estéril. Usando um bisturi estéril, remover o cerebelo e incisão para baixo da linha média do cérebro para separá-lo em dois hemisférios (Figura 1) .
5. Segure uma pequena seção de meninges em torno do hipocampo com pinças esterilizadas e puxe-o suavemente para longe. Embora não seja estritamente necessário para remover as meninges antes de isolar o hipocampo, a presença das meninges pode fazer a dissecção do hipocampo mais difícil devido à dureza da membrana. Em ambos os casos, o hipocampo será mais claramente visível após as meninges foram removidos. O hipocampo é uma estrutura curva que se inicia na parte distal do hemisfério e se dobra ventralmente (Figura 2). Como o interior, lado, côncava (caudal) está enfrentando um ventrículo, já é livre. Portanto, para isolar o hipocampo, uma precisa para cortar ao longo do lado exterior convexa. Após a dissecção, levantar delicadamente cada hipocampos com uma pinça estéreis e de transferência em um pequeno prato de cultura de tecido com aquecidos (37 ° C) HBSS sob uma capa de cultura de células. O tecido do cérebro podem ser combinados a partir de filhotes de múltiplas.

"> 3. Tissue dissociação

1. Usando um bisturi estéril, o tecido cerebral suavemente mince em 3 ml de HBSS estéril num prato de cultura 100 milímetros de Tecido.
2. Transferir o tecido picadas e HBSS para um tubo de 15 ml. Adicionar 1,5 ml de HBSS e 0,5 ml de solução de tripsina a 0,25% para um volume total de 5 ml.
3. Cap e inverter suavemente o tubo 4-5 vezes para misturar. Tentar evitar a produção de bolhas como ADN libertado a partir do tecido digerido irá aderir às bolhas e fazer com que o tecido picada para flutuar em vez de assentar no fundo do tubo (Figura 3).
4. Incubar tecido do hipocampo a 37 ° C durante 15 minutos, invertendo o tubo como acima cada 5 minutos.
5. Permitir que o tecido a assentar no fundo do tubo.
6. Cuidadosamente remover o excesso de solução utilizando uma pipeta estéril, deixando o tecido não perturbada no fundo do tubo.
7. Lavar tecido pelete com 5 ml de HBSS a 37 ° C durante 5 minutos. Repita um total de 3 vezes. Permita que o tecido completamente resolverpara a parte inferior do tubo de cada vez, antes de prosseguir para o passo de lavagem seguinte.
8. Remover a lavagem final a partir do tecido pelete e substituir com 2 ml de HBSS frescos.

4. Neuron trituração

1. Antes de iniciar os passos trituração, você vai precisar para preparar fogo pipetas Pasteur polidas. Usando um queimador Bunson, mantenha uma estéril 9 polegadas pipeta de Pasteur ponta (Figura 4a) na chama até diâmetro da abertura da pipeta é de aproximadamente 0,5 mm de tamanho e arestas da abertura pipeta foram arredondados ligeiramente (Figura 4b). Permitir pipeta para esfriar completamente antes de iniciar o processo de trituração.
2. Usando um normal estéril 9 polegadas pipeta de Pasteur, suavemente triturar o tecido um total de 7 vezes. Pedaços maiores de tecido são normais neste ponto e deve ser deixada em repouso para o fundo do tubo antes de se mudar para o passo seguinte.
3. Transferir o sobrenadante para um novo tubo estéril 50 ml.
4. Para o tecido restante, adicionar 2 ml de HBSS estéril e tritura-se um total de 5 vezes utilizando o fogo pipeta de Pasteur polida.
5. Permitir que todos os restantes pedaços maiores de tecido para assentar no fundo do tubo e combinar o sobrenadante com o sobrenadante anterior para um total de 4 ml dissociadas de células neuronais.

5. Plating célula

1. Contar as células dissociadas utilizando um hemocitómetro.
2. Como regra geral, uma vez que os números de células foram determinados, subtrair 20% a partir de número final em conta qualquer morte celular que pode ocorrer após o plaqueamento.
3. As células podem ser revestida usando as recomendações abaixo:
   Para lamelas em uma placa de 24 poços - 6 x 10 ⁴ células / poço em 0,5 ml
   Para 60 mm placas de cultura de tecidos - 4 x 10 ⁵ células / placa em 3 ml
   Para 100 mm placas de cultura de tecidos - 6 x 10 células / placa ^{de 6} em 6 ml
4. Misture o número de células apropriadas com o volume indicado de meios seletivos Neurobasal (NeurobasalMeios contendo B27 suplemento [1 ml / 50 ml], solução 0,5 mM de glutamina, 25 mM de glutamato (Mr 147,13 g / mol), penicilina (10.000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 ug / ml) [uL 250/50 ml] , 1 mM de HEPES (Mr 238,3 g / mol), 10% de calor cavalo inactivado Dador de soro) e adicionar as células a placas. Placas redemoinho suavemente para distribuir uniformemente as células. HI-Dador de soro de cavalo é adicionada aos meios sólidos para enriquecer as células durante as primeiras 24 horas de crescimento. As células são subsequentemente desmamados a partir do soro e devolvido a um ambiente isento de soro por redução de série do soro em cada substituição meios de comunicação. Deve também ser notado que, enquanto o glutamato em concentrações mais elevadas é tóxico para as culturas de células neuronais, nas concentrações mais baixas adicionado aqui, ela vai inibir a ligação de células não-neuronais ^11. No entanto, só devem ser adicionados aos meios de comunicação de revestimento para as primeiras 24 horas de cultura e subsequentemente deixada de fora de quaisquer meios de alimentação para prevenir a neurotoxicidade das células.
5. Place neurónios a 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora durante a noite.
6. Remover metade do volume dos meios de comunicação a partir das células e substituir com o mesmo volume de meios de alimentação Neurobasal (Media Neurobasal contendo B27 suplemento [1 ml / 50 ml], solução 0,5 mM de glutamina, penicilina (10.000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 ug / ml) [250 ul / 50 ml], 1 mM de HEPES (Mr 238,3 g / mol).
7. Neurónios devem ser alimentados a cada 4 dias através da remoção da metade dos meios de idade e substituindo-o com o mesmo volume de frescas meios de alimentação Neurobasal. Processos neuronais deve começar a ser visível no dia 1 (Figura 5a) e tornar-se prevalente por dia 10 (Figura 5b).

6. Os resultados representativos

A capacidade de crescer e cultura células primárias neuronais tornou-se uma parte indispensável da neurociência. As culturas primárias permitem ao pesquisador analisar específicos celulares, modificação química e tratamento, alvo loclização e padrões de crescimento em um ambiente controlado. Muitos destes procedimentos utilizar metodologia sofisticada para visualizar mudanças específicas na respostas de células. Neste caso, neurónios do hipocampo são usados ​​para estudar específicas vias neuronais que seria difícil, se não impossível para analisar no cérebro intacto. Preparação de perto de populações homogéneas de neurónios de áreas específicas do cérebro é crítica para estudar a função cerebral. Efeitos moleculares nos neurônios individuais podem ser um instrumento para delinear as vias de ordem superior, como a memória ou aprendizagem. Como este protocolo produz culturas relativamente puras de neurónios do hipocampo, sem a necessidade de uma camada alimentadora de células gliais, estes neurónios são facilmente utilizadas para estudos de imunofluorescência. No entanto, como com toda a cultura primária de órgãos contendo vários tipos de células, alguma contaminação por células menos desejados podem ocorrer. No isolamento de células neuronais, a contaminação por células gliais pode ser um problema comum. As células da glia cum ser facilmente detectadas após visualização microscópica da cultura como sua morfologia difere significativamente dos neurónios alvo (Figura 6). O impacto da contaminação de células gliais dependerá da utilização prevista das culturas. Se as células estão sendo usados ​​de imuno-fluorescência exame, a contaminação glial pode ser nada mais do que uma inconveniência ao tentar fotografar os neurônios individuais. No entanto, se as culturas neuronais são para ser utilizadas para a análise bioquímica, qualquer contaminação significativa por células gliais poderia causar grandes alterações nos resultados. Formas de lidar com a contaminação das células da glia são descritos mais detalhadamente na discussão.

Uma vez que os neurónios foram isolados com sucesso e crescidas em cultura, uma aplicação típica é examinar processos celulares imuno-fluorescência técnicas. Como ilustrado na Figura 7, organelos, tais como as mitocôndrias, podem ser coradas utilizando corantes vitais adicionados aos meios de cultura antes de fixaration. Endógenos proteínas celulares pode ser visualizada a partir de células fixas, utilizando imuno-fluorescência padrão técnicas (Figura 8). Uma vez que as células neuronais são fixos, anticorpos específicos para proteínas de interesse pode ser introduzida para a célula e estas proteínas podem ser visualizada utilizando um microscópio de fluorescência. Neurônios cultivados também fornecer o pesquisador com os meios para examinar os efeitos individuais de proteínas sobre as funções neuronais. Utilizando uma variedade de técnicas, incluindo transfecções de DNA, electroporação ou transdução virai, as proteínas podem ser superexpresso em células neuronais (Figura 9). Como neural células respondem aos efeitos do excesso de proteínas expressas podem ter consequências diretas sobre como o cérebro pode responder e oferece a possibilidade de identificar alvos celulares para os tratamentos com medicamentos. Os detalhes destes tipos de experiências de ir para além do âmbito do presente documento, mas eles não ilustram que as culturas preparados por esta técnica são adequados para uma grande variedade de baixo-saplicações TREAM. No entanto, a simplicidade global deste protocolo, bem como, o período de tempo curto necessário para preparar estas culturas neuronais tornar este um método ideal para utilização em hoje neurociência laboratório.

Figura 1. Dissecção do cérebro do rato pré-natal. A primeira incisão é baixo da linha média do cérebro separando-o em dois hemisférios.

Figura 2. Localização do hipocampo do cérebro do rato pré-natal. O corpo estriado é movido para o lado para visualizar o hipocampo e é conhecido pelo "feijão" curva estrutura do tipo na região distal de cada hemisfério.

Figura 3. Dissociação de tecido do hipocampo em solução de tripsina.

A Figura 4. Pontas de pipetas de Pasteur utilizado em trituração do tecido do hipocampo. (A) normal ponta de pipeta Pasteur. (B) Fire-polido Pasteur ponta da pipeta. Tomar nota das arestas arredondadas e da diminuição de aproximadamente 50% em pipeta tamanho de abertura.

Figura 5. Neurônios isolados usando este procedimento e banhado em NB Media. (A) O crescimento celular 1 dia pós-revestimento. Processos neuronais começar a ser visível durante o dia 1. (B) crescimento celular 10 dias pós-regulamentação, neurites são ramificadas e sobreposições.

Figura 6. Neurónios do hipocampo contaminados com células gliais cultivadas durante 7 dias e coradas com o marcador MitoTracker organela Red CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) e transfeCTED com GFP-LC3 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). As mitocôndrias são visíveis em todas as células no entanto, apenas um único neurónio com êxito foi transfectada com o construto fluorescente. A contaminação com células gliais faz análise de GFP-LC3 expressão nos processos neuronais difíceis de visualizar.

Figura 7. Neurónios do hipocampo cultivadas durante 7 dias e coradas com o marcador MitoTracker organela Red CM-H ₂ Xros (Invitrogen # M7513). Este corante vital é usado para corar as mitocôndrias activa em células de cultura de tecidos. As células foram fixadas em paraformaldeído a 4% / PBS e visualizada por microscopia de fluorescência. O corante em si é não fluorescente até oxidado na mitocôndria. Mitocôndria ativa pode ser visto ao longo dos processos neuronais.

Figura 8. neurónios do hipocampo cultivadas durante 7 dias, fixadas com paraformaldeído a 4% / PBS e imuno-coradas com anticorpo monoclonal anti β-tubulina (Sigma # T0198). Seguindo o anticorpo primário, Oregon Verde de cabra marcado anti-rato-anticorpo secundário (Invitrogen # O11033) foi adicionado e visualizada por microscopia de fluorescência.

A Figura 9. Culturas neuronais do hipocampo foram cultivadas durante 5 dias e transfectadas com GFP-LC3β construção de ADN utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). No dia 7, as células foram fixadas usando paraformaldeído a 4% / PBS e aggresomes com GFP LC3β etiquetados incorporada a sua membrana externa foram visualizadas por microscopia de fluorescência. Aggresomes estão localizados ao longo do corpo da célula e neurites e são indicados com setas.

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Discussão

Culturas de hipocampo têm sido utilizados em biologia molecular para mais de 20 anos. Embora, em princípio, culturas neuronais pode ser feito de qualquer parte do cérebro, as culturas de hipocampo provaram ser os mais populares devido à arquitectura relativamente simples da população de células nervosas no hipocampo ^7. Culturas do hipocampo são normalmente feitas de fase final de tecido embrionário. Este tecido é mais fácil para dissociar e contém menos células gliais do que o faz o tecido cerebr...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do Reagente	Vendedor	Número de Catálogo
Colágeno Rato Cauda 1	BD Biosciences	354236
Poli-D-lisina Solução	Chemicon	Um-003-E
Hanks Balanced Salt Solution	Invitrogen	14175-095
Tripsina Solução (1X) 0,25%, líquido	Invitrogen	15050-065
NeuroBasal meio líquido (1X)	Invitrogen	21103-049
B27 Suplemento (50X) líquido	Invitrogen	17504-044
L-Glutamina mM 200 (100X) de líquido	Invitrogen	25030-149
Penicilina (10.000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 ug / ml)	Invitrogen	15140-148
HI Doadores-soro de cavalo	Atlanta Biologicals	S12150H