Transferência de genes para a orelha do camundongo Desenvolvimento Inner por<em&gt; In Vivo</em&gt; Eletroporação

Resumo

A orelha interna do rato é um órgão sensorial placode derivado cujo programa é elaborado de desenvolvimento durante a gestação. Nós definimos uma In utero Técnica de transferência de gene consiste de três etapas: mouse laparotomia ventral, microinjeção transuterina, e In vivo Eletroporação. Nós usamos a microscopia de vídeo digital para demonstrar as críticas técnicas experimentais embriológicos.

Resumo

A orelha de mamífero interior tem 6 epitélios distinta sensorial: 3 cristas na ampolas dos canais semicirculares; máculas no utrículo e sáculo e do órgão de Corti na cóclea enrolada. O cristas e máculas conter células ciliadas vestibulares que transdução estímulos mecânicos para servir à especial sentido de equilíbrio, enquanto que as células ciliadas auditivas no órgão de Corti são os transdutores primários para ouvir ^1. Especificação célula destino nestas epitélio sensorial e morfogênese dos canais semicirculares e cóclea ter lugar durante a segunda semana de gestação em camundongos e são praticamente concluída antes do nascimento ^2,3. Estudos sobre o desenvolvimento da orelha interna do rato são rotineiramente realizados pela colheita de embriões transgênicos em diferentes estádios de desenvolvimento embrionário ou pós-natal para obter insights sobre a base molecular do celular e / ou morfológica fenótipos ^4,5. Nós supomos que a transferência de genes para a orelha interna do rato em desenvolvimento no útero </ Em> no contexto de ganho e perda de função de estudos representa uma abordagem complementar ao transgênese mouse tradicional para o interrogatório dos mecanismos genéticos subjacentes ao desenvolvimento do ouvido interno de mamíferos ^6.

O paradigma experimental para realizar estudos de expressão ectópica de genes na orelha do mouse desenvolvimento interior demonstrado aqui resolve-se em três etapas gerais: 1) laparotomia ventral; 2) microinjeção transuterina e 3) em eletroporação in vivo. Laparotomia ventral é uma técnica de sobrevivência do mouse cirúrgica que permite a exteriorização do útero para ter acesso experimental para os embriões implantados ^7. Microinjecção transuterina é o uso de chanfradas micropipetas, capilares de vidro para introduzir plasmídeo de expressão para dentro do lúmen da vesícula ótica ou otocyst. In vivo electroporação é a aplicação de onda quadrada, directos impulsos de corrente para dirigir a expressão de plasmídeo em ^8-10 células progenitoras.

11. Rato experimentais técnicas embriológicas pode ser difícil de aprender com prosa e imagens por si só. No presente trabalho, demonstramos os 3 passos no processo de transferência de genes. Mais criticamente, com a implantação de microscopia de vídeo digital para mostrar precisamente como: 1) identificar a orientação do embrião no útero; 2) reorientar embriões para alvejar as injeções para o otocyst; 3) microinject DNA misturado com calda de corante no otocyst nos dias embrionárias 11,5 e 12,5; 4) electroporate o otocyst injetada e 5) embriões rótulo eletroporados para a seleção pós-natal ao nascimento. Nós fornecemos exemplos representativos de sucesso transfectadas ouvidos internos, um guia ilustrado para as causas mais comuns de mistargeting otocyst; discutir como evitar erros comuns metodológicas e diretrizes presentes para escrever um in utero geno protocolo de transferência de cuidados com animais.

Protocolo

1. A laparotomia ventral

1. Anestesiar uma barragem cuja embriões são no dia embrionário 11,5 (E11.5; meio-dia no dia um rolhão vaginal é detectado é dia de desenvolvimento embrionário 0,5), por injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio da solução anestésica (7,5 uL por peso de corpo grama). Trabalhando solução anestésica: 180 uL de 50 mg / mL solução de sódio pentobarbital; 100 uL de etanol absoluto; 320 uL de 65 mg / mL de sulfato de magnésio aquoso (modula tom uterina); e 400 uL de propileno glicol (miscível veículo com uma solução aquosa e orgânica componentes).
2. Avaliar a completude da anestesia através da realização de testes de estímulos nocivos: squeeze pata; pitada cauda; e piscar de resposta ao toque bochecha e vibrissas. Aplicar pomada oftálmica estéril para as córneas.
3. Raspar o pêlo da área abdominal suprapúbica para a caixa torácica com uma tesoura e uma lâmina fina (Oster lâmina # 40). Desinfectar o abdómen com etanol a 70%, iodo povidona 10% (Betadine), umnd etanol 70%, seqüencialmente. Lugar do mouse abdômen virado para baixo em um pano estéril e em seguida, definir sobre uma almofada de aquecimento ou chapa quente (37 ° C) por 2-5 minutos.
4. Faça uma incisão na pele abdominal na linha média ventral com bola com ponta de tesoura. Alargue a incisão para 10-14 mm. Identificar a linha alba, um avascular, faixa de tecido conjuntivo branco ao longo da linha média ventral da parede abdominal. Faça uma incisão na linha alba com a bola derrubou uma tesoura e estender a incisão 10-14 mm. Imediatamente irrigar o abdômen com pré-aquecido (37 ° C) solução de Ringer com lactato.
5. Exteriorizar as duas pontas do útero com uma pinça de anel, sem aplicar pressão excessiva sobre os locais de implantação. Irrigar os cornos uterinos externalizados com pré-aquecido, solução de Ringer com lactato.

2. Microinjeção transuterina

1. Fabricar uma espessura de parede, vidro borosilicato pipeta de microinjeção capilar com as seguintes características: 12-16 μm de diâmetro exterior e um bisel de 20 graus. Em um extrator da pipeta Sutter P-97 com filamento pequena caixa, use o seguinte programa: calor = teste de rampa mais 3 unidades; pressão = 200; puxar = 0; velocidade = 46; tempo = 100). Com o beveler Sutter BV-10, utilizar o disco (ouro) 104C abrasivo para pipetas de grande diâmetro. Ressuspender o plasmídeo de expressão em ug 3-4 / uL em fosfato de cálcio livre tamponado salino (pH 7,2-7,4). Adicionar verde rápido cristalina ao concentrado DNA vórtice, suavemente durante 30 segundos, e girar a 10.000 g por 10 segundos. A quantidade mínima de verde rápido necessário para controlar visualmente a eficácia da injecção é determinada empiricamente. Aterrar a pipeta biselada com o DNA / solução de verde rápido. Ligue o pipeta microinjecção carregado para o titular da pipeta da pressão do injector (Picospritzer usando> azoto 99% puro como fonte de gás).
2. Transilluminate do útero com baixa intensidade, a luz de halogéneo para visualizar o embrião no seu local de implantação. Identificar o beating coração, vesículas cerebrais, brotos, ventrículo ^ª nascente 4 do rombencéfalo e oculares. Irrigar o útero a cada 2 minutos, com pré-aquecido e solução de lactato de Ringer para manter a hidratação. Aplique uma leve pressão sobre o útero para reorientar o embrião e identificar os pontos anatômicos mencionados acima.
3. Oriente o embrião para identificar a veia principal, cuja cabeça anterior e posterior do flanco ramos do território mesenquimal em que o otocyst reside. O otocyst adequada não pode ser visto por transiluminação do útero. O otocyst está localizado a meio caminho entre os ramos anterior e posterior da veia cabeça primário que, juntamente com o tronco principal da veia, formar a forma dos pilares ou postes de um campo de futebol americano. O otocyst está a meio caminho entre os postes.
4. Inserir a pipeta de injecção através do útero de uma trajectória em linha com a localização presuntiva do otocyst. Pulsar o microinjector uma vez, depois de passar através do uternos visualizar o corante marcador, a localização aproximada da ponta da pipeta. Avançar a pipeta sob controle micrômetro e pulse novamente para avaliar a profundidade. Avançar a pipeta no mesênquima lateral da cabeça e pulso repetidamente. Segmentação otocyst sucesso irá revelar a forma afilada do ducto endolinfático dorsalmente ea forma de concha de vieira do vestíbulo. Solte a pressão sobre o útero, remover a pipeta do embrião / útero em um movimento, e imediatamente irrigar o útero com pré-aquecido, solução de Ringer lactato.

3. Em electroporação in vivo

1. Irrigar o útero com solução de Ringer com lactato. Solução recentemente aplicado de Ringer com lactato é necessária para os eletrodos eletricamente par de remo de estilo para o útero. Umedeça as superfícies dos eletrodos de tungstênio com Ringer com Lactato. Centro da otocyst injetado no caminho dos eletrodos. Gentilmente comprimir o útero com o pa eletroporaçãoddles. O cátodo está em contacto com a parede uterina lateral à otocyst injectado eo ânodo está em contacto com a parede uterina adjacente ao otocyst não injectada. Dispara um trem de pulso de onda quadrada com o interruptor de pedal na electroporator. Eletroporação parâmetros são: 5, 50 ms pulsos em 43 volts por impulso e 950 ms de atraso interpulso. Imediatamente irrigar o útero após o trem de pulsos é entregue. Gravar a corrente fornecida ao tecido: 60-100 mAmps é suficiente para transfectar óticos progenitores epiteliais. Injectar e electroporate 4-6 embriões, E11.5 por barragem.
2. Executar um segundo, microinjecção independente transuterina de fluorescente aquosa de dextrano (Alexa Fluor 488 se o plasmídeo de expressão codifica uma proteína vermelho fluorescente ou Alex Fluor 594 se o plasmídeo de expressão codifica uma proteína fluorescente verde) para o ventrículo ^th 4 desses embriões cujo interior orelhas são injetado com precisão e pelo menos 60 mAmps de corrente por pulso era delivered durante eletroporação. O dextran fluorescente será detectado ao nascer no cérebro posterior e permitir a seleção de filhotes cujo interior ouvidos foram manipulados durante a embriogênese (ver 3.5).
3. Irrigar os cornos uterinos com Ringer com Lactato. Reinserir os cornos uterinos para dentro da cavidade abdominal. Lave a cavidade uterina com 2-4 mL de pré-aquecido, solução de Ringer com lactato e permitir que o excesso seja drenada do local da incisão para a cortina estéril. Substitua o draping com material seco e estéril. Suturar a parede abdominal com uma agulha não cortante e uma sutura reabsorvível 6-0. Nós preferimos um ponto corrido, travando cada ponto outro, tanto para a parede abdominal e da pele.
4. Seque pele das barragens e administrar um não-esteróides anti-inflamatórias, tais como Meloxicam por injecção subcutânea. Volte a represa para a gaiola de recuperação pré-aquecido em uma cortina estéril. Monitore e registre as respirações das barragens, a patência local da incisão e vagina de secreção sanguinolenta. O sangramento é rare, mas se presente e, sem trégua, a eutanásia da barragem, enquanto ela ainda está sob anestesia. Observe o tempo, ela recobra a consciência e as tentativas de deambular. Retorne a barragem para a colônia do mouse quando ela mostra sinais de comer e beber e começou a construir ninho. Tipicamente, isto ocorre no prazo de 12 horas.
5. No momento do nascimento (dia pós-natal 0), flash região rombencéfalo de cada filhote da ninhada para detectar o dextran fluorescente usando um microscópio de dissecação stereofluorescence com GFP ou Red Texas filtro definido como apropriado. Voltar para a barragem de lactação somente os filhotes que mostrar rotulagem rombencéfalo.

4. Os resultados representativos

Figura 1. Electroporação transferência de genes mediada para a cóclea em desenvolvimento. O otocyst E11.5 foi injectado com um plasmídeo de expressão de proteína de codificação verde melhorada fluorescente (EGFP) e electroporado (pulso tranos parâmetros: cinco, 43 pulsos volts a 50 ms / pulso e 950 ms de atraso interpulso). A) orelha Um representante interior a partir de um dia pós-natal 6 (P6) pup cuja otocyst foi injectado e electroporado em E11.5 demonstrando a expressão EGFP a partir da base através da espira média da cóclea. A parede lateral da cóclea foi removido da espira média e ápice só. Progenitores E11.5 que dão origem ao ápice não foram transfectadas. B) de montagem Whole imunocoloração da cóclea em (A) com o marcador de células ciliadas, miosina 7a (MYO7A), indica que a expressão EGFP segue a trajectória do órgão de Corti e é grosseiramente localizada ao cabelo epitélio célula-rolamento sensorial. C) Um representante da orelha interna de um embrião E18.5 cuja otocyst foi injetado e electroporados em E11.5. A projeção a laser confocal demonstra a expressão EGFP em MYO7A-positivos células sensoriais ciliadas. D) A projeção a laser confocal do epitélio coclear sensoriais do órgão de Corti E18.5 indicando EGFP expression nas células ciliadas internas (CCI), as células ciliadas externas (CCE), células internas phalangial (IPC), células pilar (PC), e células Deiters "(cc). A barra de escala em (B) aplica-se a (A).

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Discussão

Transferência de genes para a orelha do rato em desenvolvimento interior: A orelha do rato interior se desenvolve a partir da placode ótica durante a primeira semana de pós-implantação desenvolvimento ^12,13. Por dia embrionário 9,5 (E9.5), o placode tem invaginado e se transformou em uma vesícula cheia de líquido chamado otocyst ^2. Precursores óticos na vesícula dar origem às células sensoriais e não-sensorial dentro do ouvido interno madura, bem como os neurónios que...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Caso esterilização Micro	Roboz	RS-9900a	8X8.5X1.25 polegadas
Bola de ponta tesoura	Belas Ferramentas Ciência	14109-09
Fórceps do anel	Belas Ferramentas Ciência	11106-09	4,8 milímetros ID/6mm OD
Tecido Pinça Adson	Belas Ferramentas Ciência	11027-12
Motorista agulha	Belas Ferramentas Ciência	12502-12
Bandeja Seringa Alergia	Becton Dickison	305536
Sutura 6-0	Syneture	GL-889	0,7 sutura métrica gastrointestinal
Injeção de Ringer com lactato USP	Baxter	2B2323
Verde rápido	Sigma Aldrich	F7258
Borosilicato capilar de vidro	Harvard Apparatus	30-0053
Solução de sódio Nembutal	OVATION Pharmaceuticals Inc.	NDC 67386-501-52
MgSO4.7H2O	Fisher Scientific	M63-500
Propilenoglicol	Fisher Scientific	P355-1
Etanol	Sigma Aldrich	E7023-500
Meloxicam	Boehringer Ingeheim	NADA 141-219
Micropipeta Puller	Sutter Instruments	P-97	FB255B filamento caixa; consultar Cookbook de pipeta de instrumentos de Sutter
Beveler microeletrodo	Sutter Instruments	BV-10	Disco chanfradura 104C para pipetas grandes, consultar o manual do proprietário para biselamento teoria
Titular Micropipeta	Warner Instruments	MP-S15T	Para pipeta de 1,5 milímetros de diâmetro exterior e porta de pressão fêmea para tubagem Picospritzer.
Pinças estilo de eletrodo	Protech International Inc.	CUY650P5	5 mm de diâmetro exterior
Onda Quadrada Electroporator	Protech International Inc.	CUY21EDIT	Footpedal recomendada
PICOSPRITZER III	Parker Hannifin	051-0500-900	Footpedal recomendada
Micromanipulador Controle Manual	Harvard Apparatus	640056
Bancada de fluxo laminar horizontal limpa	Envirco		Modificações personalizadas para 630-10554 LF. Ver informações complementares para esquemática capô.
Leica stereofluorescence dissecando microcope com Lumencor motor de luz SOLA	Bartels e Stout e Lumencor	MZ10F com Lumencor motor de luz SOLA	Footpedals de enfocar o MZ10F e para acionar o motor de luz SOLA são recomendados
Alexa Fluor 594 Dextran	Invitrogen	D22913	Aquoso, 10mg/ml
Alexa Fluor 488 Dextran	Invitrogen	D22910	Aquoso, 10mg/ml
Enviro-dri	Pastor Pap Especialidadeers		www.ssponline.com