Labeling imuno dos microtúbulos no Dendrites neurônio sensorial, traquéias, e Músculos no Drosophila Wall Corpo Larva

Resumo

Para compreender como as formas de células complexas, como dendritos neuronais, são alcançados durante o desenvolvimento, é importante ser capaz de precisão organização de microtúbulos ensaio. Aqui nós descrevemos um método imuno etiquetagem robusta para analisar a organização dos microtúbulos dos dendritos arborização dendrítica neurônio sensorial, traquéia, músculos e outros Drosophila Larva tecidos parede do corpo.

Resumo

Para entender como as diferenças de formas complexas de células são alcançados, é importante seguir precisamente organização de microtúbulos. A Drosophila parede do corpo larval contém vários tipos de células que são modelos para o estudo celular e morfogênese do tecido. Por exemplo traquéias são usados ​​para examinar morfogênese tubo ^1, ea arborização dendrítica (DA) neurônios sensoriais da larva Drosophila tornaram-se um sistema primário para a elucidação da geral e neurônio-específico de classe mecanismos de diferenciação ^05/02 dendríticas e degeneração ⁶ .

A forma de ramos dendríticos podem variar significativamente entre as classes de neurônios, e até mesmo entre os diferentes ramos de um único neurônio ^7,8. Estudos genéticos em neurônios DA sugerem que a organização do citoesqueleto diferencial pode subjacentes diferenças morfológicas na forma ramo dendríticas ^4,9-11. Nós fornecemos um método de etiquetagem robusta imunológica a umssay in vivo organização de microtúbulos em DA neurônio sensorial dendrite arbor (Figuras 1, 2, Movie 1). Este protocolo ilustra a dissecção e imunomarcação de larva de primeiro ínstar, uma fase em conseqüência dendrito ativo neurônio sensorial e organização ramificação está ocorrendo ^12,13.

Além da coloração neurônios sensoriais, este método obtém etiquetagem robusta de organização de microtúbulos nos músculos (Filmes 2, 3), traquéia (Figura 3, Movie 3), e tecidos outra parede do corpo. É valioso para pesquisadores que desejam analisar a organização de microtúbulos in situ na parede do corpo quando se investiga os mecanismos que o tecido de controle e forma da célula.

Protocolo

1. Preparação de reagentes

Notas antes de começar: dissecção e coloração imuno-histoquímica são realizadas em uma câmara magnética ea larva é preso utilizando os pinos de insetos com formato especial. Instruções detalhadas sobre a construção de uma câmara magnética, ea preparação desses pinos pode ser encontrada nas referências relacionadas ^14,15. Em resumo, um buraco quadrado 1x1cm é cortada em uma folha magnética e uma lamela afixada na parte traseira da folha para fazer uma pequena câmara. Os lados da câmara são selados com cola epóxi, após esta cola não definiu a câmara é lavado várias vezes com etanol 70% antes de usar. Pinos de insetos dissecção são preparados por flexão na forma requerida e então colados em uma guia de metal ^14,15. Em alternativa a uma guia de metal, temos utilizado uma invertida de cabeça chata pin desenho de aço com uma alça feita a partir de uma ponta de corte amarela. O uso deste arranjo câmara magnética permite fechar controle over posicionamento do pino e do tecido que se estende durante a dissecção.

Para dirigir a expressão do gene repórter em subconjuntos diferentes de investigadores DA neurônios pode usar várias linhas diferentes Gal4 (resumido por Shimono e colegas ^16). Muitas dessas linhas estão disponíveis em centros de estoque público. Neste protocolo representante, realizamos imunocoloração de uma linha em que duas classes contrastantes de DA neurônio são co-marcado: o mais simples de classe I e mais complexo de classe IV (P10-Gal4 ^17,18, UAS-mCD8:: Kusabira-Orange (KO)).

1. Prepare Ca ^{+ +} livre HL3.1 salina
   1. Em mM: 70 NaCl, KCl 5, 20 MgCl _2, 10 NaHCO _3, 5 HEPES, 115 sacarose, trealose e 5; pH 7,2 ^19. Filtro-esterilizar e armazenar a 4 ° C. Nota: Ca ^{+ +} livre solução impede a contração muscular durante a dissecção.
2. Prepare tampão PHEM 2x
   1. Em mM: 130 PIPES, HEPES 60, 20 EGTA, 4 MgSO4; pH 7,0. Filtro-esterilizar e armazenar a 4 ° C.

      Nota: Estes materiais não se dissolvem até que a aproximação do pH 7.0.

3. Prepare o fixador recém imediatamente antes da fixação.
   1. A fim de preparar uma solução de 25ml, paraformaldeído 2g primeiro mix, 100μl 1M NaOH e água 10ml em tubo Falcon 50ml.
   2. Agite fixador em um banho de água 55 ° C, com agitador até que a solução é clara. (Volume total será de cerca de 11,5 ml.)
   3. Fixador fresco no gelo.
   4. Adicionar 12.5ml tampão PHEM 2x.
   5. Ajustar o pH para 7,0 com HCl 1M.
   6. Preencha a solução com água até que o volume é 25ml.
   7. Filtrar a solução usando papel Whatman.

2. Dissecação das larvas

Nota antes de começar: redes de microtúbulos, e em particular os dendritos sensorial, vai colapso rapidamente após o início da dissecção. CAhieving dissecção rápida em menos de cinco minutos, seguida pela fixação imediata são fatores chave para o sucesso deste protocolo.

1. Lavar a larva na água e rapidamente movê-los para essa queda usando um laço de cabelo.
2. Orientar a larva até lado dorsal e no lado ventral no vidro. Nota: Esta orientação é examinar os neurônios aglomerado ventral. Para examinar os neurônios aglomerado dorsal, inverter a orientação.
3. Utilizar o centro de insetos pino a pino a extremidade anterior perto da boca ganchos. Coloque o pino perto do fim para obter melhores resultados.
4. Coloque uma gota de solução salina HL3.1 na câmara de dissecção.
5. Cortar a ponta posterior da larva fora com microtesoura. Nota: Este passo abre uma abertura na parte posterior da larva que irá permitir o acesso para a microtesoura (passo 2.7).
6. Pegar com a pinça a região do intestino que agora está saindo da abertura na extremidade posterior da larva. Retire cuidadosamente o intestino todo.
7. Coloque oponta de uma lâmina do microtesoura através da abertura e corte ao longo da linha mediana ventral para o anterior.
8. Utilizando os pinos de canto, pinos nos cantos agora livre, posterior primeiro, depois anterior. Simultaneamente esticar suavemente abrir o filé larval.

3. Fixação, o bloqueio, coloração e montagem de filetes larval

Notas antes de começar: Todos os passos de fixação e coloração são realizadas na câmara de dissecção. Durante este processo, tome cuidado para não bater os pinos de insetos segurando a larva, pois isso pode levar a danos nos tecidos. Para evitar a experiência de secar, faça todos os passos coloração em um recipiente Tupperware pequena, rodeada por lenços umedecidos.

1. Aspirar o Ca ^{+ +} livre HL3.1 buffer usando uma ponta amarela. Imediatamente adicione o fixador usando outro pipetteman.
2. Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar o fixador com os traços remanescentes de Ca ^{+ +} livre HL3.1 tampãona câmara. Imediatamente aspirado-lo e em seguida, adicione fixador fresco para dentro da câmara.
3. Incubar à temperatura ambiente por 20 minutos.
4. Lavar 10mins 6x no PBST (0,1% Triton X-100 em PBS).
5. Bloco com soro de cabra 5% em PBST por 20 minutos em temperatura ambiente.
6. Substitua a solução de bloqueio com anticorpos primários diluídos em soro de cabra 5% em PBST. Os anticorpos primários utilizados são mouse anti-α-tubulina (DM1A) e de ratos anti-CD8 (5H10) ambos diluídos a 1 / 1000.

   Nota: O investigador pode desejar substituir o rato tubulina anti-α-(DM1A) com o mouse anti-Futsch (22C10) ^20,21 diluído 1 / 1000, em algumas circunstâncias (ver discussão).

7. Incubar overnight (por pelo menos 16h) a 4 ° C.
8. Lavar 10mins 6x no PBST.
9. Adicionar solução de anticorpo secundário diluído em soro de cabra 5% em PBST. Os anticorpos secundários utilizados são Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG e Cy3 burro anti-rato IgG. Manter a amostra coberta para evitar fluoróforofoto-branqueamento ^22.
10. Incubar quer no RT por duas horas, ou durante a noite a 4 ° C seguido por uma hora em temperatura ambiente.
11. Lavar 10mins 6x no PBST.
12. Coloque o filé larval no slide cutícula voltada para baixo, montado em glicerol 80%, e selar os lados da lamela com unha polonês para uma montagem de 'quick'.
    Nota: Para limpar o tecido melhorou, e uma amostra permanente e estável, montagem em DPX como descrito anteriormente ^23.

4. Resultados representativos:

Fluorescente de coloração foi analisada sob um microscópio confocal. Nas Figuras 1-2, diferentes ramos dentro de um mandril dendrite tem organização do citoesqueleto diferentes. A Figura 1 mostra uma região do mandril de uma classe IV DA neurônio no estádio 1 ^º estágio larval. O mandril todo é marcada com mCD8:: KO e detectado com um anticorpo anti-CD8 e fluorescentes secundário (Cy3). Tubulina é detectada através de anticorpos anti α-tubulina e fluorescent secundário (Alexa Fluor 488). Os ramos principais são positivos para tubulina, alguns ramos laterais finas são tubulina-negativos. Um filme é um conjunto de cortes seriados através de uma coloração semelhante de uma classe I DA neurônio. A Figura 2 mostra uma região do mandril de uma classe IV DA neurônio corados com anticorpos contra Futsch e CD8 no estádio 1 ^º estágio larval. Os ramos principais são Futsch-positivos, alguns ramos laterais finas são Futsch-negativos. Figura 3. Traquéias na parede do corpo larval mostram uma organização de microtúbulos complexo. Filmes 2 e 3 mostram cortes seriados de coloração através dos músculos da parede do corpo e da traquéia.

Figura 1. Fig. 1 mostra uma região do mandril de uma classe IV DA neurônio no estádio 1 ^º estágio larval. O mandril todo é marcada com mCD8:: KO e detectados utilizando anticorpos anti-CD8 e fluorescentes secundário (Cy3). Tubulina é detectada através de anti-&-túbulosn anticorpo fluorescente e secundário (Alexa 488). AC painéis seqüenciais confocal z-seções (0.5μm),'c-C ", manchando de anticorpos único a partir do painel Exemplo de ramos com C. (amarelo ponta de seta) ou sem (roxo seta) microtúbulos são realçados. Red arrowheads microtúbulos destaque no subjacentes células epiteliais.

Figura 2. Fig. 2 mostra uma região similar do mandril de um neurônio da classe IV corados com anticorpos contra Futsch e CD8 no estádio 1 ^º estágio larval. O mandril todo é marcada com mCD8:: KO e detectados utilizando anticorpos anti-CD8 e fluorescentes secundário (Cy3). Futsch é detectada através de anticorpos anti-Futsch e secundário fluorescente (Alexa 488). Os ramos principais são Futsch-positivos, alguns ramos laterais finas são Futsch-negativos. Exemplo de ramos com (seta amarela) ou sem (roxo seta) Futsch são realçados.

Figura 3. Traquéia coradas utilizando o protocolo anti-tubulina descrito acima. Esta larva é de terceiro instar e dissecados como descrito anteriormente ^23,24. Movie 3 mostra alargada cortes seriados do campo marcado por um quadrado.

Movie 1. Seções Serial rastreamento coloração tubulina em todo o arbor dendríticas de uma classe que eu neurônio. O mandril todo é marcada com mCD8:: KO (Magenta) e detectados utilizando anticorpos anti-CD8 e fluorescentes secundário (Cy3). Tubulina (Green) é detectado com um anticorpo anti-α-tubulina e fluorescentes secundário (Alexa Fluor 488). Escala: de um lado da imagem de vídeo corresponde a 46.88μm na seção. Clique aqui para ver o filme.

Filme 2. Seções Serial rastreamento coloração tubulina em bodmúsculos y parede de uma larva de terceiro instar. Tubulina é detectada através de anti-α-tubulina anticorpo fluorescente e secundário (Alexa Fluor 488). Escala: de um lado da imagem de vídeo corresponde a 46.88μm na seção. Clique aqui para ver o filme.

Movie 3. Seções Serial rastreamento coloração tubulina em um corpo de parede da traquéia de uma larva de terceiro instar, marcado com um quadrado no Figure.3. Tubulina é detectada através de anti-α-tubulina anticorpo fluorescente e secundário (Alexa Fluor 488). Escala: de um lado da imagem de vídeo corresponde a 46.88μm na seção. Clique aqui para ver o filme.

Discussão

Para entender o quão complexo formas de células são alcançados, é importante ser capaz de precisão organização de microtúbulos ensaio. Aqui nós descrevemos um método etiquetagem robusta imuno ensaio para a organização de microtúbulos dos dendritos arborização dendrítica de neurônios sensoriais. Além da coloração neurônios sensoriais, este método obtém coloração imuno robusto de traquéia, músculos e tecidos outra parede do corpo.

Nós usamos esse protocolo para exa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Catálogo número	Comentários (Opcional)
Fórceps	Dumont	11251-20
Microtesoura	FST	15000-08
Do mouse anti-α-tubulina (Clone: ​​DM1A)	Sigma	T9026	Diluição 1 / 1000
Rato anti-Futsch (Clone: ​​22C10), sobrenadante	Desenvolvimento Estudos Hibridoma Banco	22C10	Diluição 1 / 1000
Rat anti-CD8 (Clone: ​​5H10)	Caltag	MCD0800	Diluição 1 / 1000
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG	Invitrogen	A-11001	Diluição 1 / 500
Cy3 IgG anti-rato	Immunoresearch Jackson	712-166-150	Diluição 1 / 200