Criando poros celulares transitórios membrana utilizando uma impressora jato de tinta padrão

Resumo

Uma descrição dos métodos utilizados para converter uma HP DeskJet 500 impressora em um bioprinter. A impressora é capaz de processar as células vivas, o que provoca poros transientes na membrana. Estes poros pode ser utilizada para incorporar pequenas moléculas, incluindo fluorescente G-actina, para dentro das células impressas.

Resumo

Bioprinting tem uma vasta gama de aplicações e de significância, incluindo a engenharia de tecidos, as terapias de aplicação directa de células, e microfabricação biossensor. ^1-10 Recentemente, a impressão a jacto de tinta térmica também tem sido utilizado para a transfecção de genes. ^8,9 O processo de impressão a jacto de tinta térmica foi mostrado para interromper temporariamente as membranas celulares, sem afectar a viabilidade celular. Os poros transientes na membrana pode ser usada para introduzir moléculas, que de outra forma seriam demasiado grande para passar através da membrana, para o citoplasma da célula. ^8,9,11

A aplicação a ser demonstrado aqui é o uso de impressão a jacto de tinta térmica para a incorporação de fluorescente etiquetado G-actina em células monómeros. A vantagem de utilizar a impressão por jacto de tinta térmica para injectar moléculas nas células é que a técnica é relativamente benigna para as células. ^{8, a} viabilidade celular ¹² após a impressão tem sido demonstrado ser semelhante ao padrão de células PLAting métodos ^1,8. Além disso, a impressão a jacto de tinta pode processar milhares de células em minutos, que é muito mais rápido do que microinjecção manual. Os poros criados por impressão têm sido mostrados para fechar dentro de cerca de duas horas. No entanto, existe um limite para o tamanho do poro criado (~ 10 nm), com esta técnica de impressão, o que limita a técnica de injecção com células pequenas proteínas e / ou partículas. ^8,9,11

Um padrão de HP DeskJet 500 impressora foi modificado para permitir a impressão célula. ^{3, 5, 8} A tampa da impressora foi removido eo mecanismo de alimentação de papel foi contornado usando uma alavanca mecânica. Um palco foi criado para permitir a colocação de lâminas de microscópio e lamínulas diretamente sob a cabeça de impressão. Os cartuchos de tinta foram abertos, a tinta foi removido e foram limpos antes da utilização com as células. O padrão de impressão foi criado usando o software de desenho padrão, que então controlava a impressora através de um comando de impressão simples. Fibro 3T3blastos foram cultivadas até à confluência, tripsinizadas e, em seguida ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato com solúveis fluorescente etiquetado g de actina-monómeros. A suspensão de células foi pipetado para dentro do cartucho de tinta e as linhas de células foram impressas em lapsos de vidro de cobertura do microscópio. As células vivas foram fotografadas usando a microscopia de fluorescência e actina foi encontrado por todo o citoplasma. Incorporação de actina fluorescente para dentro da célula permite a criação de imagens de curto tempo dinâmica do citoesqueleto e é útil para uma vasta gama de aplicações. ^13-15

Protocolo

1. Convertendo o HP DeskJet 500

Deve notar-se que esta técnica deve trabalhar com muitas impressoras de jacto de tinta comercialmente. No entanto, as impressoras mais velhos tendem a funcionar melhor como eles usam os cartuchos de tinta com bicos de maior diâmetro, o que não entupir tão facilmente. Além disso, as impressoras mais velhos tendem a utilizar sensores mecânicos de alimentação de papel que são mais fáceis de contornar. Impressoras com sensores ópticos pode ser enganado, mas com uma pequena tira de papel na extremidade da impressora durante cada ciclo, mas é um pouco mais difícil do que o sistema mecânico de "truque". As impressoras que estão atualmente disponíveis no mercado que funcionam melhor em baixa resolução (DPI).

Impressoras de alta resolução tendem a obstruir mais facilmente. A resolução da HP Deskjet 500 é 300 DPI. Há muitas impressoras disponíveis no mercado (HP Deskjet série e outros) que têm uma resolução de 600 DPI. Este tipo de impressora pode ser usado com apenas um pequeno aumento no bocalentupimento questões que podem ser atenuadas com limpeza cuidadosa (seção 3).

1. Remova a tampa plástica caso da impressora, desbloqueando vários clips de plástico a partir da base inferior da impressora e, lentamente, levantando a fora superior.
2. Desaperte painel luminoso do botão / display de cima da impressora, deixando-o ligado à placa-mãe da impressora.
3. Limpar o interior da impressora, especialmente as áreas onde o cartucho de tinta repousa e onde ocorre impressão.
4. Localize os cabos que fornecem energia para os mecanismos de alimentação de papel e desligue-os da mãe.
   1. Na HP DeskJet 500, estes se encontram logo abaixo do tabuleiro de papel para a esquerda da frente.
5. Localizar mecanismo de detecção de papel. Ignorar o mecanismo pela aposição de um barbante ou fio de loop para servir como uma alça de puxar manual.
   1. Na HP DeskJet 500, o mecanismo de detecção de papel é uma alavanca em plástico cinzento encontrada acima e atrás do mecanismo de alimentação de impressão / papel.
6. Criar uma fase à frente do mecanismo de alimentação de papel (onde o papel seriam alimentados a partir de e depositada) a fim de trazer as lâminas de impressão desejadas para um nível abaixo da cabeça de impressão do cartucho.
   1. Para as nossas experiências, o detentor do transporte de espuma para tubos de centrífuga de 15 ml foi utilizado com várias lâminas de microscópio gravadas no lugar da região de impressão para trazer o nível final das lâminas para a altura desejada.
7. Para manter a técnica asséptica, a impressora pode ser colocado dentro de um gabinete padrão de risco biológico ou capuz mesa de fluxo laminar.
8. É importante notar que a modificação de um comercialmente disponível impressora de jacto de tinta será geralmente anular a garantia da impressora fabricante.

2. Conversão de ações da HP de cartuchos de tinta HP 26 (cartucho de tinta preto)

1. Remova o cartucho de sua embalagem, deixando a fita protetora que cobre os contatos da impressora ea cabeça de impressão para o momento.
2. Estabilizar o corpodo cartucho (parte preta) ou com uma pinça ou vício (simplesmente segurando firmemente o cartucho pela mão geralmente funcionou tão bem), deixando clara a verde cima de qualquer obstáculo.
3. Utilizando um alicate ou uma chave ajustável, puxe a parte superior verde do cartucho e torcer frente e para trás várias vezes até que ele se liberta.
   1. Isto não deve levar muita força, mas o topo não é mais necessário, por isso é ok se quebra quando removê-lo.
4. Usando chaves de fenda, retire o pedaço de plástico transparente agora exposta.
   1. Novamente, isto não deve ter muita força, mas não vai ser necessário, por isso é bom em caso de quebra durante a remoção.
5. Esvaziar qualquer remanescente a partir do reservatório.
6. Remova a fita plástica cobrindo os contatos da impressora ea cabeça de impressão.
7. Lavar bem os reservatórios com água.
   1. Usar uma pipeta ou uma seringa para empurrar a água através dos canais.
   2. A água provavelmente vai vazar da cabeça de impressão duranteNeste processo, o que é aceitável, e não causa qualquer dano para a funcionalidade do cartucho.
8. Quando a água corre claro, permitir que o cartucho para secar.

3. Limpeza Tinteiro

1. A fim de manter um ambiente de impressão limpo, o cartucho de tinta deve ser limpo antes e após a utilização.
   1. Isto também ajuda a evitar com cristalização de sais e outro material biológico no cartucho que poderia causar bloqueios.
2. Totalmente submergir o cartucho num copo cheio de água desionizada, e sonicar durante 15 minutos antes e após a impressão.
3. Após sonicação, remover o cartucho da água, e agitar para fora o excesso de água.
4. Pulverização de etanol 70% para dentro do cartucho para criar um ambiente mais asséptico.
   1. Assegurar que o etanol foi seca antes da adição da solução de impressão bioink.

4. Fazer Suspensão Cell - "Biotinta "

1. Células em cultura até o momento de passagem.
   1. Para fibroblastos 3T3: células de sementes em frascos T-75 a cerca de 1.3x10 ⁴ células / cm ² no Dulbecco Modificado Eagles (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS). Células de cultura para dois dias numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.
2. Fazer solução stock fluorescente g-actina em concentração de 50 ug / ml em solução de tampão fosfato (PBS).
3. Células de passagem.
   1. Para fibroblastos 3T3: Remova a mídia de frasco e lavar duas vezes com PBS. Cobrir as células com 5 ml de 0,25% de tripsina + EDTA e incubar durante 5 min.
   2. Adicionar 5 ml de meio fresco e pipetar a suspensão da célula em um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. Aspirado gasto médio.
4. Ressuspender as células em PBS com fluorescente de solução stock g-actina para criar bioink.
   1. Bioink deve ter uma concentração final de G-actina de 10 ug / ml e um co célulancentration de 1x10 ⁵ células / ml. Esta concentração foi otimizado para limitar a quantidade de células por queda e entupimento da cabeça de impressão ^8.
   2. Note-se que 250 uL de bioink imprime três lamelas com o padrão mostrado na Figura 2.

5. Bioprinting

1. Ligue e deixe a impressora aquecer.
2. Local desejado superfície de impressão (aqui, usamos 22 mm x 22 mm lamelas) no centro da fase preparado no passo 1.6.
3. Crie um arquivo padrão de impressão.
   1. Abra o Microsoft Word (ou qualquer outro software de desenho), e desenhar o padrão desejado.
   2. Escolha um padrão de impressão desejada para a impressão de célula no arquivo premade.
4. Carregar o cartucho preparada com a suspensão de célula desejado.
   1. Pipetar suspensão para as pequenas circular bem na parte inferior do compartimento de cartucho. Use aproximadamente 100-120 ml de solução. O tamanho de gota é de cerca de 130 impresso⁸ picolitros.
5. Imprima o arquivo com a HP Deskjet 500 Printer.
   1. Para melhores resultados, imprimir padrões menores várias vezes (5), por alteração da quantidade de cópias desejadas no programa de processamento de texto.
6. Printer vai esquentar de novo, então cartucho vai mover para a posição "pronto".
7. Quando cartucho se move para a posição de pronto (ligeiramente para a esquerda do gotejamento tinta bem abaixo e permanece aí), puxar para cima sobre o fio mecanismo de alimentação de papel, e de impressão deve ser iniciada.
   1. Para várias cópias do impressão, o mecanismo de alimentação de papel terá de ser libertado depois de cada ciclo, ou página impressa. O cartucho irá retornar para a posição "pronto", eo papel do fio mecanismo de alimentação deve ser aumentada novamente.
8. A impressora vai imprimir sobre a lamela colocado no centro da fase de impressão na etapa 5,2 (ver Figura 2).

6. Resultados representativos

Os resultados representativos do processo de conversão inteira de uma norma, off-the-shelf HP Deskjet 500, padrão HP 26 cartuchos série irá criar uma impressora com capacidade de impressão de soluções de celulares para muitos tipos de análise como mencionado anteriormente. A impressora concluída após a conversão é mostrado na Figura 3, com uma fase de impressão para colocar o lamela de microscópio em. A impressora pode ser útil em análise em muitos campos, incluindo, mas não se limitam a: simples mecânica de células, engenharia de tecidos, a transfecção de genes, micropatterning biossensor, e terapias de células directos ^{1-10, 16-22.}

Neste exemplo, uma impressora HP Deskjet 500 impressora e cartuchos de tinta HP 26 da série foram modificadas para bioprinting. Utilizando esta configuração impressora com um bioink consistindo de uma suspensão de células de fibroblastos em uma solução de monómero G-actina, as células foram impressas em lamelas de vidro para microscópio. A Figura 1 ilustra res representativos ÜLTS de células de fibroblastos impressos, que mostram incorporados monómeros de actina fluorescentes. Os resultados foram obtidos num ambiente controlado asséptica na qual as células foram impressas em padrões de personalização.

O padrão usado neste exemplo foi criado no Microsoft Word (Figura 2). Este padrão criada uma linha contínua da solução de impressão em toda a maioria da lâmina de microscópio. A Figura 4 mostra a linha recta na qual o bioink e as células são mutuamente depositado. Deve notar-se que, imediatamente após a impressão, há um aumento de fluorescência de fundo, porque a solução bioink, no qual as células são suspensas, contém livres excesso monómeros de actina fluorescentes. Esta fluorescência de fundo diminui significativamente após a adição de meios de crescimento nas células (Figura 1), que lava monómero excesso a partir do substrato.

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Figura 1. Imagens representativos de fibroblastos 3T3 de 3 horas após a impressão usando a impressora de jacto de tinta modificada. O interior das células mostram incorporados monómeros de actina fluorescente etiquetado. Barras de escala representam 50 um.

Figura 2. Projeto usado para imprimir bioink.

Figura 3. Printer após a conversão com o estágio de isopor. O fio de laranja no meio ignora o papel sensor de alavanca de alimentação.

Figura 4. Imagem representativas de fibroblastos 3T3 impressas em uma zona de impressão localizada. Imagem de microscopia retiradas 5 minutos após a impressão, com ampliação de 20x.

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Figura 5. Imagem de fluorescência (ampliação de 40x) tomado 3 horas após a impressão a exibir um fibroblasto com internalizadas monómeros de actina fluorescentes. Barra de escala representa 50 um.

Figura 6. Microscopia de fluorescência (ampliação de 20x) de uma célula tomado 15 minutos após a impressão. A imagem mostra tanto g-actina (verde) eo núcleo (azul). Da esquerda para a direita: g-actina com Alexa Fluor 488, núcleo com DAPI, e uma sobreposição de ambos.

Figura 7. Microscopia de fluorescência mostrando dois fibroblastos em um padrão de linha de 3 horas após a impressão. Imagem do lado esquerdo mostra monómeros de actina fluorescente etiquetado dentro das células. Imagem à direita é uma sobreposição do canal fluorescente com a imagem de fundo para mostrar que, emborapode haver alguns detritos na corrediça (canto inferior esquerdo), não fluorescente. Barras de escala representam 50 um se não o tamanho indicado a extrema-direita é um grupo controle de não-impressos células incubadas por 3 horas com monômeros fluorescente etiquetado. Este controlo é mostrar que os monómeros não pode penetrar a membrana da célula sem permeabilização da membrana através de impressão célula.

Discussão

O processo para converter uma impressora jato de tinta para desktop padrão bioprinting não é particularmente difícil. O passo mais difícil é determinar a forma de contornar o mecanismo de alimentação de papel, que é dependente da marca e modelo de impressora usado. No entanto, isso é relativamente simples quando o sensor de alimentação de papel é mecânico como descrito aqui. Para os modelos com sensores ópticos de alimentação, outras técnicas podem precisar de ser empregada para enganar a impressora em pensar que está usando papel, por exemplo, pode-se executar um pequeno pedaço de papel através da impressora, enquanto ele imprime na lâmina de microscópio. Ignorando o mecanismo de alimentação de papel é provável que seja o passo mais difícil na aplicação destes procedimentos para diferentes modelos de impressoras.

Ao construir uma fase para segurar as lamelas para impressão, é importante para garantir o alinhamento correcto ea altura. A fase deve permitir a lamela para ser colocado no meio da área de impressão. Além disso, deve-se plÁs lamela a uma altura adequada para permitir uma folga para o cartucho de tinta para passar sobre a lâmina sem interromper-lo. A altura exacta da fase dependerá do modelo da impressora.

Para assegurar que as células não são impressos lavados, as lâminas foram colocadas numa incubadora imediatamente após a impressão, durante aproximadamente 30 minutos para permitir a ligação de células antes de meios de crescimento adicionais de células foi adicionado. Como as células foram impressas em uma solução que inclui grandes quantidades de PBS as células não secar e permaneceu viável. As células foram visualizados utilizando microscopia de fluorescência para visualizar a distribuição dos etiquetados g de actina-monómeros dentro da célula (Figuras 1, 5-7). Quando a impressão com fibroblastos 3T3, a Figura 5 mostra um resultado representativo, com a actina causando muito da célula para fluorescência, mas mostrando linhas de brilho aumentado. A incorporação de fluorescentemente marcado g-actina no citoesqueleto éútil para o estudo da dinâmica do citoesqueleto e mecânicos celulares. ^12-15 Uma limitação desta técnica é que ela só é aplicável para moléculas e proteínas que têm diâmetros menores do que cerca de 10 nm.

Para assegurar que as células foram realmente a ser processado pela impressora convertido, DAPI (1:5000 em PBS) foi adicionada à bioink no lugar de metade do volume de PBS puro. O DAPI fluorescente mancha liga-se a porções de aminoácidos ricas de DNA localizados no núcleo. Portanto DAPI é uma mancha útil na fluorescência núcleos das células de imagem impressos. A Figura 6 mostra uma imagem representativa de uma célula apresentando tanto Alexa Fluor 488 (actina) e DAPI de fluorescência (núcleo) com uma imagem de sobreposição de ambos. Figura 7 ilustra também como as células fluorescem uma vez que os monómeros de actina-g foram incorporadas enquanto não biológico material que foi depositado na amostra não fluorescência devido à absence de G-actina monómeros.

Uma consideração importante para bioprinting é os meios aquosos sendo usados ​​para a bioink. Verificou-se que a utilização de meios de crescimento de células normais com soro produziu resultados inconsistentes. Isso é mais provável devido ao entupimento dos bicos da cabeça de impressão de proteínas séricas. A utilização de PBS aumentou a consistência de padrões impressos e do número de células depositadas. Uma desvantagem de usar PBS é que as células não deve ser deixado na suspensão por períodos prolongados de tempo. No entanto, fibroblastos em estes exemplos foram capazes de tolerar as condições bioink para pelo menos uma hora, sem qualquer alteração da viabilidade celular. Isto é consistente com várias conclusões anteriores, que relatam que as células impressas por meio de mecanismos de jacto de tinta térmicos têm sido demonstrado que têm taxas de viabilidade elevadas. ^2-8

Esta configuração da impressora modificado pode ser utilizado para outras aplicações do que a impressão célula. ^16-22 proteínas da matriz, tais como colagénio ou fibronectin, pode ser facilmente impressa sobre substratos com esta técnica, que pode ser útil para padronização célula. Por exemplo tipo de colagénio, I impresso em padrões de linhas irá resultar em substratos de colagénio alinhadas que podem ser utilizados em estudos de cultura in vitro de células. ¹⁷ Além das proteínas da matriz, outras moléculas, incluindo factores de crescimento, pode ser fiavelmente localizada sobre substratos para estudos de células e potenciais aplicações terapêuticas. ^{de 18}

Uma limitação importante na concepção do descrito nas etapas acima é que esta impressora não é capaz de imprimir em mais de uma dimensão. Isto limita o potencial para a utilização em aplicações tais como a impressão estampados andaime. Para permitir a impressão em 3D, uma fase especializado precisa de ser utilizado. O estágio precisa ter ajustes de altura incrementais para camada por camada, deposição de bioink.

Bioprinting mostrou a promessa como um método eficiente e custo-eficaz para a engenharia de tecidos, Fabricação gene micropatterning transfecção e microarray ^{1-12, 16-22} As aplicações futuras deste tipo de dispositivo são numerosos, incluindo:. Criação de controlados e padronizados microambientes celulares, incorporação de macromoléculas no citoplasma da célula, e deposição de células para andaimes e estruturas que não ocorrem naturalmente ou de forma eficiente.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
HP DeskJet 500	Hewlett-Packard	C2106A	Descontinuado do fabricante. Comprado remodelado Trader dezembro
HP 26 Cartucho de tinta preto	Hewlett-Packard	51626A
Actina de músculo de coelho, conjugado com Alexa Fluor 488, 200 mg	Invitrogen	A12373
Tampão fosfato salino (PBS)	Biomedicals MP	ICN1860454
Dulbecco Modificado Eagles (DMEM)	Thermo Scientific	SH3002201
Soro Fetal Bovino	Sigma-Aldrich	F4135
A anfotericina B	Sigma-Aldrich	A2942	Usado em 0,5% em meio de cultura de células
Penicilina-Estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333	Usado em 0,5% em meio de cultura de células
Bench fluxo unidirecional Limpo	Envirco	VLF 797	Habitação opcional para impressora mantendo asséptica