Um modelo fechado de tórax murino de isquemia do miocárdio e reperfusão

Resumo

O trauma cirúrgico induz uma resposta inflamatória. As citocinas e ligandos endógenos são conhecidos para modular o tamanho do enfarte do miocárdio após isquemia e reperfusão. Apresentamos um modelo modificado fechado de tórax murino de isquemia e reperfusão utilizando pesos pendurados para minimizar os efeitos de toracotomia.

Resumo

O trauma cirúrgico, por toracotomia de tórax aberto em modelos de ligadura coronária induz uma resposta imune que modifica diferentes mecanismos envolvidos na isquemia e reperfusão. A resposta imune inclui a expressão de citocinas e de libertação ou secreção de ligandos endógenos de inatos receptores imunes. Ativação da imunidade inata pode potencialmente modular tamanho do infarto. Nós modificamos uma já existente modelo fechado de tórax murino usando pesos pendurados que podem ser úteis para o estudo do miocárdio pré-e pós eo papel da imunidade inata na isquemia miocárdica e reperfusão. Este modelo permite animais para se recuperar de trauma cirúrgico antes do início da isquemia do miocárdio.

Os anestésicos voláteis foram intensamente estudados e seu efeito de pré-condicionamento para o coração isquémico é bem conhecida. No entanto, este efeito protector impede a sua utilização em modelos de tórax aberto de ligação da artéria coronária. Assim, uma outra vantagem pode ser a utilização de thde e bem controláveis ​​anestésicos voláteis para a instrumentação em um modelo fechado de tórax crônica, uma vez que seu efeito de pré-condicionamento dura até 72 horas. Doenças cardíacas crônicas com isquemia intermitente e modelos de vida são múltiplas outras possíveis aplicações deste modelo.

Para o modelo fechado de tórax crônica, ratos intubados e ventilados submetidos a uma toracotomia lateral brusco através do 4 º espaço intercostal. Na sequência de identificação do descendente anterior esquerda uma ligadura é passado por baixo do vaso e ambas as extremidades de sutura são enfiados através de um oclusor. Em seguida, as duas extremidades de sutura são passados ​​através da parede torácica, em espiral para formar um laço e deixado no tecido subcutâneo. Após o encerramento peito e recuperação por 5 dias, os ratos são anestesiados novamente, a pele do peito é reaberto e pesos pendurados são conectados ao circuito sob controle de ECG.

No final do protocolo de isquemia / reperfusão, corações podem ser marcadas com TTC para enfarteavaliação do tamanho ou sofrer fixação de perfusão para permitir estudos morfométricos além de histologia e imuno-histoquímica.

Protocolo

1. Indução da anestesia

1. Para a indução com isoflurano, coloque o rato em uma caixa de indução que é ligado ao conjunto de vapor a 3,0% vol e fluxo de oxigénio de 0,5 L / min.
2. Após inconsciência é obtido com estímulo tátil não de induzir uma resposta e do membro anterior ou hindlimb reflexo de retirada pedal estar ausente, coloque o mouse em uma mesa de operação com temperatura controlada em decúbito dorsal. Manter a anestesia ao longo de um cone nasal que está ligado ao vapor através da caixa de indução. Reclinar a cabeça, fixando os incisivos superiores com fio de náilon 5-0 para facilitar a intubação.
3. Inserir a sonda de temperatura rectal para manter a temperatura corporal a 37 ° C. Fixar as extremidades com fita adesiva. Cruze a perna esquerda sobre a perna direita para abrir o peito esquerdo e expor o coração melhor.
4. Aplique o creme depilatório para o pescoço e peito esquerdo. Limpe o creme após 1 minuto. Aplicar iodopovidona para local da peledesinfecção. Injectar a buprenorfina peso corporal 0,05 mg / kg para o alívio da dor, por via subcutânea.
5. Faça uma incisão na pele da linha média do pescoço com uma tesoura pequena. Blunt dissecar as glândulas e músculos que cobrem a traqueia. Ligue o ventilador. Configurações do ventilador deve ser ajustada para parâmetros fisiológicos. Nós usamos um Minivent, Hugo Sachs Elektronik, Harvard Apparatus com uma freqüência respiratória de 105/min e um volume corrente de 200 ul. Puxe a língua com uma pinça e suavemente inserir um tubo de metal G 22. Confirmar a intubação pela visualização direta do tubo dentro da traquéia e movimento do tórax.
6. Ignorar a caixa de indução por comutação para o lixo tubagem de gás para evitar a contaminação do espaço de laboratório. Ajuste de vapor a 2,0% vol.

2. Toracotomia

1. Faça uma incisão na pele na linha hemiclavicular esquerda. Blunt dissecar o tecido subcutâneo para a axila. Identificar a fronteira do músculo peitoral maior e neutralizar dissecá-lo a partir da p menormusculares debaixo ectoralis. Puxe o músculo peitoral menor para a direita. Você vai ganhar uma visão direta da caixa torácica.
2. Identificar e sem rodeios pentetrate 4 º espaço intercostal com pinça. Deixe as pontas das pinças preenchem o espaço intercostal se permitir inserir os afastadores que são ajustadas com bandas de borracha presas à mesa de operação. Você deve ter uma visão clara do coração, incluindo a aurícula esquerda. Esse acesso é geralmente conseguido sem qualquer perda de sangue e, assim, sem a necessidade de coagulação eléctrico.

3. Preparação do Coração

1. Suavemente retire o pericárdio sem ferir o coração.
2. Identificar a artéria descendente anterior esquerda (LAD), levantando fora da aurícula esquerda atrial a partir da parede anterior do ventrículo esquerdo. LAD será visto só ao longo de um curso curto hetero com bordas desfocadas e de cor vermelho brilhante, em comparação com as veias.

4. Arterial CoronarianaInstrumentação

1. Preparar uma sutura prolene 8-0 com uma ponta da agulha através da formação de afunilada-lo em forma de U. Passe a agulha através do miocárdio profundo o suficiente debaixo da LAD.
2. Cortar a extremidade da agulha de sutura para ter 1 cm de sutura em cada lado.
3. Cortaram uma seção de 1 mm PE-10 como um tubo de oclusor impedindo quaisquer cantos afiados. Permitir que a prótese de molho em desinfecção alcoólica e bater para fora antes do uso. Nota: O tubo deve ser de imersão em etanol 100% por 24 horas para esterilizar adequadamente ^4.
4. Sutura ambas as extremidades por meio da prótese.
5. Use um tamanho de 3 agulha de sutura Kalt para guiar tanto sutura extremidades para fora do espaço superior intercostal.

5. Encerramento peito

1. Amarrá a nervura superior e inferior do espaço aberto intercostal, juntamente com uma sutura de prolene 6-0. Antes de fechar o baú que você deve proceder para 5,2.
2. Hiperinflacionar os pulmões por alguns ciclos respiratórios para abriraté atelectasia por clampeamento do tubo expiratório. Esta manobra pode também depender do tipo de ventilador que você usa. Defina o volume corrente até 300 ml até o peito está fechado.
3. Defina o ventilador volta do volume corrente para 200 ul.
4. Amarrá ambas as extremidades da sutura ligadura 8-0 LAD tê-los formar um laço.
5. Anexar um ECG.
6. Ligue-se os pesos ao lacete 8-0 e deixar os pesos cuidadosamente travar. Você deverá ver uma significativa elevação do segmento ST dentro de algumas batidas de coração. Libertar os pesos. Nota: Estas experiências utilizar um total de 5,5 g de peso, mas o peso pode variar em função da linhagem e do peso corporal de ratos.
7. Coloque o circuito em uma bolsa subcutânea e fechamento da pele com 6-0 nó simples.
8. Deixe o mouse recuperar após a extubação debaixo de uma lâmpada de aquecimento.

6. Isquemia miocárdica e Reperfusão

1. Após um período de recuperação de pelo menos 5 dias induzir a anestesia com uma mistura de cetamina, xilazinae atropina (4 ml / kg de peso corporal, a cetamina 10 mg / ml, xilazina 2 mg / ml, atropina 0,06 mg / ml, ^1.
2. Intubar e ventilar com ar ambiente para experimentos de isquemia e reperfusão.
3. Abra a pele suturada do peito. Preparar o laço de sutura 8-0. Anexar um ECG.
4. Ligue-se os pesos e deixá-los cair. Siga o seu protocolo de isquemia. Assista ECG para dissolução potencial de elevação do segmento ^ST-2.
5. Libertar os pesos no final da isquemia. Feche a pele, extubação o mouse e deixá-lo recuperar.

7. Avaliação tamanho do enfarte com tempo de reperfusão até 3 dias

1. Anestesiar e entubar o mouse no final do tempo de reperfusão desejado.
2. Corte a pele do tórax na linha média para o xifóide. Abra o abdômen e cortar o diafragma abaixo da caixa torácica. Cortar o tórax aberto em ambos os lados da linha hemiclavicular.
3. Fixar a parede do tórax agitou anterior com uma sutura para ganhar acesso livre para o coração.
4. Preparar cuidadosamente o laço de sutura 8-0. Corte o laço e dê um nó para ocluir o LAD.
5. Injectar 10% ftalocianina azul para o átrio esquerdo. Para evitar sobrecarga de volume cardíaco, injetar lentamente tingir e aspirar ao longo do tempo.
6. Injectar cloreto de potássio para o átrio esquerdo. Isso vai parar o coração em diástole para avaliação igual tamanho do infarto.
7. Cortar o coração, deixando o máximo de tecido extracardial quanto possível para facilitar o corte do coração.
8. Lavar o coração em solução tampão de fosfato.
9. Congelar o coração em azoto líquido e isopentano. Alternativamente, os corações pode ser colocado num congelador até levemente congelado.
10. Cortar o coração em fatias de 1 mm. Nós temos um dispositivo de corte feita de lâminas de barbear para cortar o coração em fatias iguais (Figura 4). Assegure-se que o coração está correctamente alinhados para cortar perpendicular ao eixo longo do coração.
11. Incubar as fatias em 1,5% de TTC a 37 ° C durante 20 min. Usamos uma placa de 96 poços, ondecada fatia é colocada em um poço. Isso vai poupar TTC e poupar o uso de um filtro Whatman para evitar artefatos.
12. Fixe as fatias com formaldeído a 4% durante a noite. Isto irá reduzir as fatias mas melhora o contraste do corante.
13. Coloque a fatia numa lâmina de microscópio. Cubra com outro slide. Use 1 espaçadores de metal mm em cada extremidade da lâmina e mantenha as lâminas em conjunto com clipes de papel.
14. Tome uma imagem digital a partir de ambos os lados de cada fatia. Sempre use as mesmas configurações e não ampliar para fatias menores.
15. Use um software de planimetria. Usamos ImageJ pelo NIH. Sempre use os mesmos critérios para áreas infartadas, por exemplo, apenas áreas em branco são infarto. Áreas brancas rosadas não infartado. Nós cegos investigadores para intervenções e planimetria bem.

8. Preparação Coração alternativa para Histologia

1. Siga os passos 7.1 a 7.2. e proceder a 8,2. Avaliação confiável do infarto com a coloração TTC pode ser feito dentro de 72 horas de reperfusão por causa da retração da cicatriz.
2. Prepare-se fora de qualquer tecido extracardial e neutralizar dissecar o timo cobrindo a raiz da aorta.
3. Agarre a aorta ascendente com a pinça e cortar o coração com tecido como menos extracardíaco possível.
4. Lave e esprema delicadamente o coração em solução cardioplégica.
5. Colocar o coração em um prato de p35 cheio com solução cardioplégica.
6. Preparar a aorta ascendente.
7. Canular a aorta ascendente com uma cânula que é pré-preenchido com formaldeído. Usamos zinco-formalina fixador e uma linha de 24 G iv ^3.
8. Corte um buraco entre a aurícula esquerda e átrio esquerdo.
9. Inserir um cateter G 26 para dentro do átrio esquerdo com um tubo de 16 cm de comprimento ligada a ela. Você também pode usar um tubo PE50.
10. Perfundir o coração durante dez minutos com o fixador formalina.
11. Colocar o coração em um tubo cheio com o fixador para um máximo de 24 horas a 7 ° C.
12. Continue com a preparaçãoparação para histologia / imuno-histoquímica.

9. Os resultados representativos

Ligadura da artéria coronária crônica é uma técnica complexa, com várias armadilhas. No entanto, uma vez que é dominado ela pode ser realizada com taxas de mortalidade muito baixos e os resultados altamente fiáveis. Posicionamento ideal dos ratos e de acesso ao coração são cruciais para a identificação bem-sucedida e instrumentação do LAD. A posição da ligadura irá, obviamente, influenciar o tamanho do enfarte, exigindo assim a ter um local de ligação normalizada. Além disso, se ramos septais são afetados isto poderia levar a um bloqueio de ramo em vez de elevação do ST. Sangramento de veias epimiocárdicos ou do ventrículo, se a ligação é muito profundo, pode ocorrer e ratos deve ser excluída se o sangramento é excessivo. Pericard deve ser removido, tão completamente quanto possível. Deixando o Pericard irá agravar empurrando a agulha no myocard para ligação. Além disso, ele irá causar pericardite, eventualmenteinduzir aderências e fará exame histológico difícil. A PE-prótese deve ser tão curto quanto possível, sem quaisquer cantos afiados para minimizar o trauma para myocard. A hiperinflação dos pulmões é absolutamente crucial para evitar pneumotórax hipertensivo após o fechamento do tórax. Não há necessidade de uma drenagem torácica. Ensaios de uma posição correcta da ligadura no tórax aberto, puxando as extremidades de sutura deve ser omitidos porque puxando tensão é difícil de controlar. Se instrumentação da LAD falhar, outras tentativas deve ser evitado porque isto irá adicionar trauma e edema para o miocárdio.

A fim de alcançar resultados fiáveis, parâmetros de protocolo deve ser padronizada. Portanto, os ratos são entubados e ventilados com ar ambiente ea temperatura do corpo é rigorosamente controlada com um sistema de realimentação. O uso de pesos de suspensão já foi enfatizado. Outros dispositivos de tracção têm a desvantagem de perda de tensão e não padronizado a tensão de puxar. Isquêmicaprotocolos pré-e pós com múltiplos ciclos de reperfusão e oclusão são mais facilmente realizadas com pesos pendurados, porque eles só precisam de ser levantada e deixar pendurado (Figura 1).

Áreas de infarto (branco) deve ser distinguível de áreas de risco (vermelho) e área não menos riscos (azul) (Figura 2A-B). Infarto tamanhos são dependentes duração da isquemia. Tempo de reperfusão deve ser de pelo menos 2 horas para permitir a coloração TTC bem sucedida (Figura 1 e 2). Mais importante ainda, a expressão de citocinas RNA é baixa nos animais operação simulada que tinham todos os procedimentos cirúrgicos, excepto isquemia e reperfusão, em comparação com os animais que foram submetidos a enfarte do miocárdio (Figura 3A-C).

Figura 1. Infartar tamanho em percentagem de área em risco (IS /% AAR). Camundongos submetidos a 30 minutos de isquemia seguido por 120 minutos de reperfusão (I / R, n = 10). IPC: pós-condicionamento isquémico, os ratinhos foram submetidos a 30 minutos de isquemia seguidos por 3 ciclos de reperfusão / oclusão 20 seg cada (n = 6, * indica p <0,05).

Figura 2A. Representante fatia coração TTC-manchado. Branco: área de infarto, Vermelho: área de risco, Azul: não-ocluído área.

Figura 2B. Fatia representativa de uma área (branco) infartado. Note-se que, devido à forma cónica da estreita ventrículo esquerdo para o vértice, a epimyocard aparecerá como área plana e não deve ser considerado para a medição planimétrico (rosa / azul área externa). Vermelho = TTC manchada myocard viável.

Figura 3A. Não houve diferença significativa na minhaocardial TNF-α expressão do mRNA após 30 minutos de isquemia e 120 minutos de reperfusão. n = 4-6 por grupo.

Figura 3B. Expressão do mRNA do miocárdio IL-1β após 30 minutos de isquemia e 120 minutos de reperfusão (I / R). Não existe diferença significativa entre o controlo (sem cirurgia) e sham operado (não isquemia / reperfusão) grupo. n = 4-6 por grupo, * indica p <0,05.

A Figura 3C. Miocárdica IL-6 a expressão do mRNA após 30 minutos de isquemia e 120 minutos de reperfusão (I / R). Não existe diferença significativa entre o controlo (sem cirurgia) e sham operado (não isquemia / reperfusão) grupo. n = 4-6 por grupo, * indica p <0,05.

A Figura 4A-C. Heart dispositivo de corte. A: fechado com lâminas de barbear em posição de corte. B: vista, aberto lado. C: ponto de vista, aberto da frente. Coração serão alinhados na ranhura do leito de plástico branco com o seu eixo maior perpendicular às lâminas de barbear (seta).

Discussão

Nós modificamos um modelo fechado de tórax murino, acessando o coração através de uma toracotomia lateral intercostal esquerdo e levando as suturas LAD no peito esquerdo na linha hemiclavicular. Saindo da caixa torácica óssea intacta irá minimizar o trauma, a necessidade de medicação para a dor, infecção de sítio cirúrgico e assim, facilitar a recuperação. Ao preservar a esquerda da artéria mamífero interna não há necessidade de electrocauterização. Deixamos o laço de sutura no tecido subcutâneo ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Vapor	Drägerwerk AG	Isoflo
Microscópio	Leica	M80
Fonte de luz	Schott	KL 1500 LCD
Unidade de Controle homeotérmicos Blanket	Harvard Apparatus
MiniVent Tipo 845	Hugo Sachs Elektronik
8-0 Prolene	Ethicon	BV130-5 6,5 milímetros 3/8C
6-0 Prolene	Ethicon	BV-1 9,3 milímetros 3/8C
Kalt agulha de sutura 3	FST	12050-03
Trifeniltetrazólio	Sigma Aldrich	93145
Phthalo azul	Heucotech LTD
PowerLab	ADInstruments