Testes clínicos e Remoção da Medula Espinhal em um modelo do rato para a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA)

Resumo

Um modelo do rato para a esclerose lateral amiotrófica (ELA) é examinado clinicamente e comportamentalmente. Como um pré-requisito para uma análise imuno acompanha a preparação da medula espinal é descrito em detalhe.

Resumo

Esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma desordem neurodegenerativa fatal resultando em degeneração progressiva dos motoneurónios. Pico de início é em torno de 60 anos para a doença esporádica e em torno de 50 anos para a doença familiar. Devido ao seu curso progressivo, 50% dos pacientes morrem dentro de 30 meses de início dos sintomas. A fim de avaliar as opções de novo tratamento para esta doença, os modelos murinos genéticos de ALS foram gerados com base em humanos mutações da família no gene SOD, tais como a mutação SOD1 (G93A). Aspectos mais importantes que têm de ser avaliados no modelo são em geral curso de sobrevivência, clínica e da função motora. Aqui, demonstramos a avaliação clínica, mostram a realização de dois testes motores comportamentais e fornecer sistemas de pontuação para todos os parâmetros quantitativos. Porque uma análise em profundidade do modelo de mouse ALS normalmente exige um exame imunohistoquímico da medula espinhal, que demonstram a sua preparação em detalhe a aplicação do fazermétodo laminectomia Rsal. Exemplares achados histológicos são demonstrados. A aplicação integral dos métodos de exame descritas em estudos sobre o modelo do rato de ALS permitirá ao pesquisador confiável testar futuras opções terapêuticas que podem fornecer uma base para mais tarde ensaios clínicos humanos.

Protocolo

Os animais foram adquiridos a Jackson Laboratory (# 002,726) ^1. Eles são clinicamente marcados e submetidos a um teste de função motora (rotarod teste) e da força muscular (pendurado teste do fio). Todos estes ensaios ea morte dos animais mais tarde, a fim de preparar a medula espinal foram realizados em conformidade muito perto das orientações locais para a conduta apropriada de experiências com animais.

1. Pontuação clínica

Para além da avaliação para os ratos de peso corporal são examinados para sinais de déficit motor com o seguinte sistema de pontuação de 4 pontos ^2:

4 pontos: normal (sem sinal de disfunção motora)

3 pontos: tremores nos membros posteriores são evidentes quando suspenso pela cauda

2 pontos: anormalidades da marcha estão presentes

1 ponto: arrastando de pelo menos um membro posterior

0 ponto: simétricoincapacidade paralisia, para a direita em si ou a perda de 20% do peso corporal máximo; neste caso, os animais são sacrificados imediatamente ea experiência é terminada

2. Testes da função motora e força muscular

Pendurado fio

Este teste é utilizado para avaliar a força muscular ^{3, 4.} Todos os animais realizar este teste, pelo menos, um ou dois dias após o teste de rotarod. Cada rato é colocado em uma tampa de arame sob medida com intervalos de 0,8 cm e cautelosamente virou de cabeça para baixo, 60 cm acima de um fundo de palha coberto. Após a formação por três vezes consecutivas de pelo menos 180 s a latência para cair é medido. Cada rato é dada até três tentativas para segurar a tampa invertida para um máximo de 180 S e no período mais longo é gravado.

Rotarod Teste

O aparelho rotarod (Ugo Basile, Comerio, Itália) foi usado para medir a coordenação motora, equilíbrio e capacidade de aprendizado motor ^{3, 4.} Um bom desempenho requer um elevado grau de coordenação sensório. A máquina deve ser colocado em um ambiente calmo e não-perturbador para evitar estímulos de interferências para o animal testado. É constituída por uma controlado por computador do fuso motorizado rotativo e cinco pistas durante cinco ratinhos. Quedas dos ratinhos são detectados automaticamente pela pressão sobre uma placa de plástico na parte inferior. Após a formação por três vezes consecutivas de pelo menos 180 S a uma velocidade constante de 15 rpm, o tempo para o qual um animal pode permanecer sobre a haste rotativa é medido. Cada animal passa por três provas e mais longa latência, sem cair é gravado. O tempo de 180 s é escolhido como cut-off tempo, porque a maioria das diferenças significativas na coordenação motora são detectados neste espaço de tempo.

3. Preparação da Medula Espinhal

1. Os animais são mortos por insuflação de CO _2, de acordo com as orientações locais e são imediatamente perfundido transcardially com solução de PBS, seguido por uma solução de paraformaldeído a 4%.
2. A fim de preparar a medula espinal do rato sacrificados, o animal é colocado sobre uma mesa de operação e os quatro membros são fixados no lado, a fim de expor o lado de trás do rato.
3. Um curto da lavagem com uma solução de etanol a 70% limpa o local de dissecção e achata a pêlo.
4. Em seguida, a pele é incisão com um bisturi afiado na linha mediana. A fim de facilitar o corte da pele é esticada para ambos os lados. Se os músculos das pernas devem ser preparadas, sua pele também tem de ser feita uma incisão.
5. Após a incisão na pele é completado, é puxado para o lado com um par de pinças para expor a fáscia superficial do corpo.
6. A musculatura do pescoço e do ligamento nucal tem que ser removido e são carefully preparado. Tenha cuidado para não incisar a profundamente e lesão na medula espinhal. Os músculos do ombro também pode ser removido de modo a melhor expor a coluna vertebral.
7. Em seguida, os músculos paravertebrais são removidos a partir de toda a coluna vertebral.
8. A fim de abrir os laminectomias da coluna vertebral vários têm de ser realizados. Deve-se começar a partir da parte superior do crânio no local da articulação atlanto-occipital.
9. É mais fácil remover a fixação dos dois membros superiores e esticar o pescoço para ser mais capazes de realizar a laminectomia das vértebras primeiro. Estes são afastou sem tocar o exposto medula espinhal cervical.
10. Mais vértebras são removidos por primeiro rasguem a arcos vertebrais em ambos os lados com uma tesoura em ângulo e, em seguida, puxando os processos dorsal. Restantes partes laterais das vértebras devem ser removidos para facilitar a posterior remoção completa da medula espinhal.
11. Um marco anatômico da espinha lombarl é o cabo de intumescência que também está presente na medula cervical.
12. Tendo terminado a laminectomia de toda a medula espinhal, certifique-se que você também transect todas as raízes ventrais e liberar a medula espinhal a partir da dura-máter das meninges.
13. Em seguida, a medula espinhal cervical cranial é cortado e você começa a remover a medula espinhal.
14. Finalmente, a medula espinhal é também cortado na cauda distal-eqüina para ser completamente liberado.
15. Em última análise, a medula espinal é colocado dentro de uma solução postfixating (por exemplo, paraformaldeído a 4%) durante a noite e podem ser posteriormente tratados. Nós geralmente cryosection da medula espinhal para prepará-lo para análise imuno.

4. Os resultados representativos

A técnica de preparação da medula espinal representa o foco deste artigo de vídeo. É um pré-requisito essencial para o seccionamento de tecidos mais tarde e, finalmente, para análise imuno de espinhaCabo seções l. Como um exemplo de um resultado final, um workup imuno-histoquímica da região corno anterior do rato medula espinal lombar de um tipo selvagem (wt) e de um SOD G93A transgene (TG) do rato é demonstrada. Neurónios motores pode ser identificado com um anticorpo anti-ChAT primária e subsequente marcação fluorescente com um anticorpo secundário Cy3. Além disso, um nuclear contra-mancha com DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) foi realizada (Figura 1).

Figura 1. Fotomicrografias fluorescentes visualizando a imunodetecção de motoneurónios com anticorpo anti-ChAT (vermelho) e núcleos celulares contra-mancha por DAPI (azul) no corno cabo de rato vertebral lombar anterior de um tipo selvagem (wt) (à esquerda) e do um SOD G93A transgênicos (TG) (à direita) do mouse com a idade de 130 dias. Barra de escala: 40 mM.

Como a análise imuno-histoquímica deos ratinhos de SOD G93A não é o âmbito primário deste artigo consultar a publicação original em que estes ratinhos transgénicos foram caracterizados e os mais recentes que estudam abordagens terapêuticas para referência futura ^{1, 5, 6.} Se os efeitos terapêuticos deve ser diferenciado do nível imuno claramente definida algoritmos de avaliação quantitativa deve ser aplicada suportado por um software estereológica (por exemplo ver ^7).

Discussão

A SOD1 (G93A) modelo do rato genético é um valioso modelo animal para estudar o curso da doença de perda progressiva dos motoneurônios comparável à esclerose amiotrófica lateral, humano ^8. Uma variedade de paradigmas de tratamento diferentes foram avaliados neste modelo e representam uma base para posterior teste em humanos ^8-10 estudos clínicos. A fim de ser capaz de detectar diferenças significativas em um estudo de tratamento experimental nestes ratinhos, é de importância primordial p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
	Fabricante	Informações para pedidos
Testes comportamentais
Rota-Rod para Ratos	Ugo Basile, Comerio, Itália	# 47600
Pendurado dispositivo fio	Feito sob encomenda
Preparação da Medula Espinhal
Tabela Operação A luz de funcionamento Luvas de protecção
"Iris" Tesoura, angulado a lado	Belas Ferramentas ciência, Heidelberg, Alemanha	14063-09
Cohan-Vannas Tesoura Primavera, em linha reta	Belas Ferramentas ciência, Heidelberg, Alemanha	15000-10
Micro pinça	Hammacher, Solingen, Alemanha	HWC 111-10
Bisturi "präzisa plus"	Dahlhausen, Köln, Alemanha	11.000.00.510, a FIG 10