Transplante de ilhotas pancreáticas para a cápsula renal de ratos diabéticos

Resumo

Nosso protocolo foi desenvolvido para fornecer precisão e facilidade ilhotas ou células sob a cápsula renal de camundongos. Células estão concentradas em pelotas na tubulação final utilizada para o transplante de células sob a cápsula renal. A facilidade desta técnica reduz o estresse nas células e mouse.

Resumo

Nosso protocolo foi desenvolvido para fornecer precisão e facilidade ilhotas ou células sob a cápsula renal de ratos diabéticos ou normal. Descobrimos que era mais fácil concentrar as ilhotas ou células em pelotas na tubulação de entrega final (PE50) utilizado para o transplante de células sob a cápsula renal. Esta técnica fornece a velocidade e facilidade, reduzindo qualquer estresse para as células ou para o mouse.

Loading: Settled, escolhidos a dedo, ou células ilhotas peletizadas são cuidadosamente aspirado fora da parte inferior de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando um pipetteman p200 e uma reta, de parede fina ponta da pipeta. Um comprimento de tubos PE50 está ligado à ponta da pipeta usando um tubo de pequeno adaptador silicone. Células estão autorizados a resolver, na ponta, e depois são transferidos para o tubo PE50 lentamente por marcar o pipetteman. Uma vez que as células estão perto do fim do tubo PE50, uma torção é feita eo adaptador de tubo de silicone é colocado sobre o kink. A tubulação PE50 é transferido para a 15 mL uma pipeta de corte cônico contendo 5 mL, e os tubos PE50 é gravado sobre o lado da pipeta de 5 mL para evitar curling durante a centrifugação. Células podem chegar a 1.000 rpm e parou.

Transplante: ratos são anestesiados destinatário, raspada e limpa. Uma pequena incisão é feita no flanco esquerdo do mouse e do rim está exposto. O rim, tecido adiposo, tecido e são mantidas úmidas com uma compressa de soro fisiológico. A extremidade distal do PE50 é anexado a uma seringa Hamilton movimentação do parafuso, contendo uma ponta de pipeta, usando o tubo adaptador silicone. Um nick pequeno é feito no lado do flanco direito do rim, não muito grande nem muito profundo. O fim chanfrada do tubo PE50, mais próximo das células, é cuidadosamente colocada sob a cápsula, a tubulação é movido suavemente para dar espaço ao mesmo tempo limpando soro fisiológico; uma cápsula seca pode rasgar facilmente. Uma pequena bolha de ar é fornecido sob a cápsula por lentamente marcação da unidade de rosca seringa. Ilhotas são entregues em seguida, lentamente por trás da bolha de ar. Homeostase renal uma vez que as ilhotas foram entregues é mantido e os knick é cauterizado com fogo baixo. O rim é colocado de volta na cavidade e do peritônio e da pele são suturados e grampeados. Ratos são imediatamente tratados com Flunixina quadrados e buprenorfina e colocado em uma jaula em uma almofada de aquecimento.

Protocolo

Preparação de Ilhotas para Transplante (Tx)

1. Em microscópio invertido, mão pick-ilhotas usando um Pipetman P200 e ponta da pipeta em linha reta do ilhotas cultivadas em uma placa de 100mm.
2. Contagem de 100 ilhotas de cada vez e transferir para cada tubo de microcentrífuga (~ 500 ilhotas tubo / / mouse).
3. Permitir ilhotas para resolver a parte inferior dos tubos de microcentrífuga.
4. Desenhe uma das ilhotas pellet em um Pipetman P200 (fixado em 130ul) usando uma ponta da pipeta em linha reta de parede fina.
5. Coloque um adaptador de tubo de silicone sobre a ponta da seringa. Inserir um comprimento de tubulação PE50 no adaptador silicone.
6. Pendurar o Pipetman para o lado da capa e fita da tubulação PE50 à parede capô superior as ilhotas na ponta. Isso permitirá que as ilhotas de resolver apenas na ponta da pipeta.
7. Transferência das ilhotas na tubulação PE50 por lentamente discar o Pipetman e movendo as ilhotas na tubulação PE50, tomando cuidado para não expulsar os ilhéus a partir do final.
8. Faça uma torção no final chanfrada do tubo PE50. Mantendo a torção, desconecte o tubo adaptador de silicone do Pipetman e segura a torção com o adaptador silicone.
9. Coloque as ilhotas, no PE50 tubulação dobrada lado de silicone, tubo adaptador para baixo, em um 15 ml cônico com uma pipeta mL cortar 5 e tape o tubo PE50 sobre o lado da pipeta de 5 mL para evitar curling da tubulação PE50 enquanto centrifugação.
10. Centrifugar a conicals PE50/15mL a 1000 rpm e desligar centrífuga. (Nunca prepare mais de 10 preparações das ilhotas de uma só vez).
11. Coloque o tubo no gelo.

Preparação de mouse para Transplante

1. Anestesiar os ratos com isofluorano ou com Ketamina / Xylexene (ver protocolo de preparação).
2. Após anestesia tomou afeto, raspar o flanco esquerdo do mouse.
3. Swab pele de rato, centro-out, com swab iodopovidona e depois limpe com um algodão embebido em álcool etílico.
4. Localizar o rim esquerdo (logo à direita do baço). Fazer uma pequena incisão na pele, expondo o peritônio.
5. Fazer uma pequena incisão no peritônio expor o rim. Mantendo a pequena incisão irá ajudar na manutenção do rim levantadas e expostas.
6. Aplique uma leve pressão para ambos os lados da incisão, aumentar ou pop do rim para fora do mouse.
7. Manter a umidade do rim através da aplicação de soro fisiológico com um algodão com ponta cotonete.
8. Usando uma seringa de 23 ou 25 agulha, faça um pequeno arranhão no flanco direito do rim, a criação de um nick na cápsula renal, não muito profundas ou muito grande.

Transplante de ilhotas

Nota: Enquanto o mouse está sendo preparado para Tx, a segunda pessoa deve preparar o Hamilton parafuso drive-seringa transplante de ilhotas.

1. Lentamente, retirar a mangueira do adaptador de silicone do tubo PE50, mantendo o kink na tubulação.
2. Coloque a extremidade oposta do tubo PE50 no tubo adaptador de silicone e colocar o tubo adaptador de silicone na ponta da pipeta anexado à seringa de vidro "parafuso-drive" Hamilton. Lentamente, liberte o kink na tubulação PE50, certificando-se que as ilhas não vazar.
3. Avançar a ilhotas lentamente até a ponta do tubo PE50 usando o "parafuso" mecanismo, mas manter uma pequena bolha de ar na frente das ilhotas na tubulação PE50.
4. Para o nick fez no rim, deslize cuidadosamente o tubo PE50 sob a cápsula, fazendo uma pequena bolsa. Tenha muito cuidado para não arrancar o rim ou punção através da cápsula.
5. Ela ajuda a manter a área e úmido de algodão cápsula com solução salina Gentamicina normais embebido ponta cotonete; uma cápsula seca vai rasgar facilmente.
6. Mova cuidadosamente o tubo em todas as direções, criando uma "bolsa" para as ilhotas transplantadas para descansar. Lembre-se de reaplicar o soro fisiológico adicional para manter a área úmida.
7. Sob a direção da pessoa que abriu o mouse e que tem colocado o tubo PE50 sob a cápsula renal, a segunda pessoa, que preparou o mouse e Hamilton seringa transplante, lentamente vai avançar ilhéus sob a cápsula, dentro do "bolso", atrás de uma pequena bolha de ar emitido pela tubulação PE50, até que todas as ilhotas são transplantadas.
8. Lentamente, retirar a mangueira PE50, seque a área com um cotonete seco e cuidadosamente cauterizar o nick em lume brando.
9. Usando um cotonete de algodão seco ponta, certifique-se todas as sangramento parou. Uma vez que o sangramento parou, re-umedecer o rim com solução salina estéril, e gentilmente substituir o rim para o peritônio antes do fechamento do mouse com grampos de sutura e pele.

Fechamento / Revival of Mouse

1. Fechar o peritônio com um ponto em execução usando seda 5-0 w / a agulha C-6 19mm.
2. Forceps desenhar usando ambos os lados da incisão na pele junto.
3. Pele o grampo, juntamente com 2 ou 3 grampos.
4. Limpe a pele do mouse de qualquer sangue, usando um cotonete de algodão com ponta e saline.
5. Imediatamente tratar o mouse com uma injeção subcutânea de Flunixina e buprenorfina.
6. Posicione o mouse em uma gaiola, que é colocada sobre uma almofada de aquecimento ou abaixo de uma lâmpada de aquecimento, até que o mouse é totalmente ativo.
7. Remova os grampos de pele em duas semanas.

Discussão

Este protocolo fornece uma opção prática e eficiente para fornecer precisão e facilidade ilhotas ou células sob a cápsula renal de ratos diabéticos ou normal. A técnica de concentração e as ilhotas de granulação ou células ao tubo de final (PE50) utilizado para o transplante de células sob a cápsula renal oferece um método fácil e eficaz de transplante de células, reduzindo qualquer estresse para as células ou para o mouse.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical gloves	Fisher Scientific	11-394-95(sz)
Surgical scrub sponges	Moore Medical	42940AK
Forceps	Miltex Inc.	6-114 and 6-26	2 with teeth, 2 straight
Dissecting scissors n=2	Miltex Inc.	5-290
Oster razor (sz. 40 blade)	Fisher Scientific	01-305-10B
4x4 Sterile gauze pads	Moore Medical	08252AK
Povidone Iodine pads	Moore Medical	08486AK
Alcohol pads	Fisher Scientific	14-819-2
Heating pad	Moore Medical	42508AK
23G or 25G needles			1" long
Cidex solution	Moore Medical	07535AK	for cleaning/santizing instruments
PE50 polyethylene tubing	BD Biosciences	427411	PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D.
Cidex + 28 day soln	Moore Medical	35625AK
Silicone tubing	Spectrum Chromat.	123732	5/32”OD x 1/32” ID
Instrument sterilizing container	Moore Medical	39074AK
Straight Pipet Tips	USA Scientific, Inc.	1111-0810	sterile
Glass syringe w/screw-drive	Hamilton Co	1001
Cauterizing tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS230
Needle Holder	Moore Medical	41-067
5-0 silk	LOOK Surgical	754B	for suture (6-C)
Cotton tipped swab	Moore Medical
9mm autoclip stapler	BD Biosciences	7630
9mm staples	BD Biosciences	7631
9mm staple remover	BD Biosciences	7637