Sensor de microagulhas baseado oco para Multiplexed Transdermal Eletroquímica Sensing

Resumo

Este artigo detalha a construção de um sensor de microagulhas multiplexados baseado. O dispositivo está a ser desenvolvido para a amostragem in situ ea análise electroquímica de analitos múltiplos de uma maneira rápida e selectiva. Nós encaramos a medicina clínica e pesquisa biomédica usa para esses sensores baseados microagulhas.

Resumo

O desenvolvimento de um sistema de monitoramento minimamente invasivo multiplexados para análise rápida de moléculas biologicamente relevantes poderia oferecer aos indivíduos que sofrem de doenças crônicas avaliação simplista de seu estado fisiológico imediato. Além disso, poderia servir como uma ferramenta de pesquisa para a análise de complexos, multifatoriais condições médicas. A fim de que um tal sensor de multianalyte a ser realizado, ele deve ser minimamente invasiva, a amostragem de fluido intersticial deve ocorrer sem dor ou danos para o utilizador, e análise deve ser rápida, bem como selectiva.

Inicialmente desenvolvido para a dor livre de entrega da droga, microagulhas têm sido utilizados para fornecer vacinas e agentes farmacológicos (por exemplo, insulina) através da pele. ^1-2 Uma vez que estes dispositivos de acesso ao espaço intersticial, microagulhas que são integrados com microeletrodos pode ser usado como transdérmica sensores eletroquímicos. Detecção selectiva da glucose, o glutamato, lactato, hácido ydrogen peróxido, e ascórbico foi demonstrada utilizando integrados microagulhas de eléctrodos de dispositivos com fibras de carbono, pastas de carbono modificados e microagulhas platina revestidos de polímero que servem como elementos de transdução. ^3-7,8

Esta tecnologia de sensor de microagulhas permitiu uma nova e sofisticada abordagem analítica para detecção in situ e simultânea de múltiplos analitos. Multiplexing oferece a possibilidade de controlar microambientes complexos, que são de outro modo difícil de caracterizar de forma rápida e minimamente invasiva. Por exemplo, esta tecnologia pode ser utilizado para monitorização simultânea dos níveis extracelulares de, lactato, glicose e pH ^9, que são importantes indicadores metabólicos de estados de doença ^7,10-14 (por exemplo, cancro da proliferação) e induzida por exercício acidose. ¹⁵

Protocolo

1. Fabricação de microagulhas

1. Usando modelagem tridimensional software Solidworks (Dassault Systemes SA, Velizy, França), criar um piramidal em forma de matriz de microagulhas oco (Figura 1) ^3-5.
2. Projetar uma estrutura de suporte para a matriz de microagulhas usando Magics RP 13 software (Materialise NV, Leuven, Bélgica). A estrutura de suporte permite que a resina para drenar a partir do dispositivo durante a fabricação e fornece uma base sobre a qual as microagulhas são construídas. Uma estrutura de suporte exemplo é mostrado na Figura 1.
3. O apoio ligado e arquivos de matriz microagulhas são enviados para o RP Perfactory software (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Alemanha), que controla o processo de fabricação. Dentro deste pacote de software, escolha o número de matrizes microneedle a ser fabricados e determinar a colocação de dispositivos na placa de fabricação.
4. Executar calibração em modo de ultravioleta a 180 mW para a rápida Perfactory prototyping sistema de fabricação e verificar o desvio de energia está dentro de ± 2 mW.
5. Uma vez que a fabricação está completa, remove as matrizes microneedle a partir da placa de base e desenvolver-se em isopropanol, durante 15 minutos. Secam-se as matrizes com ar comprimido e curar as microagulhas à temperatura ambiente durante 50 segundos no Sistema Postcuring Otoflash (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Alemanha) para assegurar a polimerização completa.
6. Validar fabricação microneedle via microscopia e verificar que cada furo de microagulhas é oca e sem obstruções. Microagulhas totalmente-fabricadas são mostrados na Figura 2.

2. Fabricação de matrizes de carbono eletrogel

1. Utilizar um modelo de 60 W 6,75 CO ₂ raster / vector sistema de laser (Universal Laser Systems, Inc., Scottsdale, AZ) para cortar furos e expor as subjacentes individualmente endereçáveis ​​fios de cobre de ligação de um cabo flexível plana (21039-0249), que foi obtido a partir de uma fonte comercial (Molex conector Corp, Lisle, IL) (Figura 3 (A e B)). Colocar os cabos planos flexíveis em um gabarito para alinhar adequadamente los na placa de ablação por laser. Usar uma abordagem rastering para criar 500 cavidades diâmetro uM na porção de isolamento do cabo flexível. Padrões para ablação são criados no CorelDraw (Corel, Ottawa, Ontario) e enviado para o sistema de laser.
2. Limpe os planos modificados cabos flexíveis com um aerógrafo que sprays acetona a 40 psi. Termine a limpeza-los por lavagem com água deionizada e isopropanol. Verificar sob um microscópio de que nenhum filme isolante permanece sobre as tiras de cobre expostas.
3. O passo seguinte é o de criar uma cavidade de retenção para a embalagem de pastas de carbono. Fita Melinex (0,002 espessura "revestida em um único lado com adesivo acrílico sensível à pressão) é cauterizado com o mesmo padrão que as tiras de eléctrodos, orientadas ao longo das tiras de eléctrodos cauterizado, e comprimido a 3000 psi durante 2 minutos para assegurar uma ligação adequada. Em esta case, o diâmetro da cavidade é de 750 mM.
4. Uma camada adicional de fita Melinex (0,004 "espessura revestida em dois lados com adesivo acrílico sensível à pressão) é subsequentemente ablated no mesmo padrão que a fita de lado único adesivo e é usado após o alinhamento para ligação das matrizes microneedle para as matrizes de carbono eletrogel .

3. Síntese das Pastas de carbono funcionais e Embalagem de cavidades Eletrodo

1. A glicose de pasta de carbono sensível é baseado fora de uma receita anterior, e é obtida por mistura de 10 mg de glicose oxidase e 2,2 mg de poli (etilenimina) até uma mistura homogénea. ¹⁶ A esta mistura, 60 mg de ródio sobre carbono em pó ( 5% de carga) é adicionado. 40 mg de óleo mineral é adicionado e, subsequentemente, misturado. As pastas são armazenadas a 4 ° C até à sua utilização, as pastas são utilizados até uma semana após a preparação.
2. O pH de pasta de carbono sensível é obtida por mistura de óleo mineral a 30% (w / w) e 70% (w / w) de grafite powder. Embale cole na cavidade do eletrodo como descrito na seção 3.4. Fazer solução de 10 Fast Blue RR sal de diazónio mM (4-benzoilamino-2 ,5-dimethoxybenzenediazonium cloreto de hemi sal (cloreto de zinco)) em 0,5 M de ácido fosfórico. ^17, colocar uma gota 20 uL desta solução sobre o eléctrodo de pasta embalado para 30 minutos para espontaneamente chemisorb o Fast Blue sal de diazônio PR. Enxágüe com água deionizada e armazenar em buffer ou água deionizada quando não em uso.
3. A pasta de carbono lactato sensível é baseado fora de uma receita anterior, e é obtida por mistura de 2,5 mg de ródio sobre carbono em pó e 2,5 mg de lactato-oxidase, alternando entre 5 minutos de sonicação e 5 minutos de agitação em vórtice durante cinco rotações. ¹⁸
4. Embalagem das pastas modificados no cabo plano preparada flexível é realizado através da aplicação das pastas respectivas sobre as cavidades dos eléctrodos. Usando uma parte fina de plástico (por exemplo, uma aresta de um barco de pesar de plástico) como uma espátula e t pacoteele colar até uma superfície lisa é alcançada. Repita com um barco limpo segunda pesagem até colar em excesso é removido. Lavar com água desionizada. Um esquema que mostra a ablação de laser para criar cavidades, a embalagem de pastas de carbono, e de microagulhas integração (descrito no ponto 2 e 3) é apresentada na Figura 3.

4. Detecção e calibração de sensores

1. Detecção de lactato é conseguido através da medição da resposta cronoamperométrica do sensor a -0,15 V e de registo da corrente após 15 segundos em tampão fosfato 0,1 M (pH = 7,5). Figura 4 (a) contém um diagrama esquemático da reacção eletrocatalítica para a detecção de lactato .
2. Detecção de glicose é realizada de uma maneira semelhante, medindo a resposta cronoamperométrica do sensor a -0,05 V e de registo da corrente após 15 segundos em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,0). Figura 4 (b) contém um diagrama esquemático da reacção eletrocatalítica para detection de glicose.
3. pH é monitorizado por execução cíclicos varreduras voltamétricas de -0,7 V a 0,8 V a 100 mV / s, e gravando a posição do pico potencial oxidativo. Um esquemática das reacções redox para a detecção de pH é mostrado na Figura 5.
4. As curvas de calibração para a glicose e os sensores de lactato pode ser criado por adições sucessivas de substância a analisar respectivo; medições cronoamperométricos estão realizando depois de cada adição do analito, como descrito nas secções 5.1 e 5.2. Alternativamente, fixos potenciais medições cronoamperométricos pode ser feita sob agitação enquanto permite que o tempo suficiente (~ de 10-100 segundos) entre cada adição analito para a estabilização de corrente.
5. as curvas de calibração de pH pode ser criado através da medição da posição do potencial de pico oxidativo longo de uma série de valores de pH conhecidos 5-8 em incrementos de 1,0 unidades de pH e gravando voltamogramas cíclicos como descrito na secção 5.3.

5. Re Representantesultados

Quando a obtenção de curvas de cronoamperometria (por exemplo, para a detecção de glicose ou de detecção de lactato) em soluções quiescentes de carbono modificado com cole-cheias microagulhas, a corrente irá diminuir de imediato a pedido do respectivo potencial de detecção. Será, eventualmente decair para um valor de estado estacionário. Um resultado representativo é mostrado na Figura 6, sendo este resultado foi obtido a partir de 2 adições mM de lactato e gravação na microagulhas lactato. A solução deve ser brevemente agitada após cada adição de lactato. A corrente após 15 segundos sobe sobre o aumento da concentração de lactato; a resposta de corrente pode então ser usado para determinar a concentração de lactato em uma solução desconhecida. Alternativamente, a monitorização contínua pode ser usado em uma solução agitada (ou em uma solução de fluxo) tal como demonstrado por uma solução com uma concentração de glicose crescente (Figura 5). Novamente, o aumento na corrente mediante o aumento tele concentração de glucose pode ser usada para padronizar a resposta da glucose a uma solução desconhecida. Tempo suficiente deve ser permitido após cada espiga, a fim de permitir que a solução para estabilizar. Os voltamogramas cíclicos na microagulhas sensível ao pH em 0,1 M de tampão fosfato são mostrados ao longo de quatro soluções de pH diferentes, de 5 a 8 em incrementos de 1 unidade de pH na Figura 6. Os turnos oxidativas de pico potenciais com o aumento do pH; este fenómeno é usado como um indicador do valor do pH.

Figura 1. Imagens do arquivo STL da matriz de microagulhas criado em Solidworks (A) e da tela de impressão, que mostra a estrutura de suporte (B).

Figura 2. Scanning micrografias electrónicas da matriz de microagulhas (A) e uma única microagulhas dentro deste matriz (B).

Figura 3. Esquema de montagem de cabo plano flexível. Os passos envolvidos incluem modificando o cabo plano flexível (A), a ablação dos círculos estampados (B), adicionando o inicialmente ablated camada Melinex, que é enchido com pasta de carbono (C), bem como a adição do segundo camada Melinex ablacionada e acasalamento o microneedle array (D). Clique aqui para ver maior figura .

Figura 4. Calibração de lactato-sensível pasta com 15 segundos scans cronoamperométricos -0,15 V em tampão fosfato 0,1 M (pH = 7,5). Cada aumento na corrente corresponde a uma adição de 2 mM de lactato.

Figura 5. Calibração de pasta de glucose-sensível executando scans cronoamperométricos em -0,05 V. Cada diminuição da resposta corresponde a uma adição de 2 mM de glucose. O 0,1 M de solução de tampão fosfato (pH = 7,0) foi agitada durante a calibragem. Externo de Ag / AgCl e Pt de referência e eléctrodos de contador foram utilizados neste estudo.

Figura 6. Voltamograma cíclico (CV) de carbono sensível ao pH colar em tampão fosfato 0,1 M ao longo de pH 5-8 em incrementos de 1 unidade de pH (pH 8,0 = verde azulado, verde = pH 7,0, púrpura = pH 6,0, vermelho = pH 5,0). Um quinto CV foi utilizada para análise contra Ag / AgCl referência e os eléctrodos do contador de Pt de arame.

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Discussão

Múltiplos aspectos da concepção deste sensor microneedle baseado foram considerados antes da fabricação do dispositivo. A fim de utilizar este sensor para detecção em tempo real, o tempo de resposta do sensor deve ser baixa; neste protocolo, cada sensor testados exibiram um tempo de resposta inferior a quinze segundos. Pastas utilizadas neste protocolo foram também escolhidos por sua seletividade dentro em ambientes in vivo, que contêm biomoléculas eletroativos que podem interferir na respost...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Cabo flexível plano	Molex	3302/10SF
0,003 fita Side "face	Melinex
0,004 "fita dupla face	Melinex
Lactato-oxidase	Sigma	L0638
Glucose oxidase	Sigma	G7141
Ródio sobre carbono	Sigma	206164
Pó de grafite	Sigma	385031000
poli (etilenimina)	Acros	178570010
Óleo mineral	Sigma	M5904
Glicose	Sigma	G8270
Lactato	Sigma	L1750
Fast Blue RR sal	Sigma	F0500
Shell e-300	EnvisionTEC
Shell e-200	EnvisionTEC
Ag / AgCl eletrodo de referência	Basi	MF-2052
Fio de Pt	Basi
PGSTAT12 AutolabPotentiostat	EcoChemie
Perfactory RP	EnvisionTEC
Ottoflash sistema Postcuring	EnvisionTEC
O ácido fosfórico	Pescador	A366-4
60W Modelo 6,75 CO 2 raster / vector sistema laser	Universidadesal Laser Systems	PLS6.75
CorelDraw	Corel
Solidworks	Dassault Systemes	2009
Magics RP13	Materialise