Preparação de fatias agudas zona subventricular for Imaging Cálcio

Resumo

Um método para carregar subventricular zona (SVZ) de células com corantes de cálcio indicador de actividade de cálcio gravação é descrito. A SVZ pós-natal contém células hermeticamente embalados, incluindo as células progenitoras neurais e neuroblastos. Ao invés de usar o carregamento banho foi injetado o corante por pressão dentro do tecido, permitindo uma melhor difusão de corante.

Resumo

A zona subventricular (SVZ) é uma das duas zonas de origem neural no cérebro pós-natal. A SVZ contém células densamente, incluindo as células progenitoras neurais com características astrocíticos (chamados astrócitos SVZ), neuroblastos e células progenitoras intermediárias. Neuroblastos nascidos no SVZ tangencialmente migrar uma grande distância para o bulbo olfativo, onde se diferenciam em interneurônios. Sinalização através de moléculas de adesão intercelular e sinais difusíveis desempenham papéis importantes na neurogênese de controle. Muitos destes sinais de desencadear a actividade do cálcio intercelular, que transmite a informação dentro e entre as células. Actividade de cálcio é, portanto, reflexo da actividade de sinais extracelulares e é uma forma optimizada para compreender sinalização intercelular entre as células SVZ funcional.

Actividade de cálcio foi estudada em diversas outras regiões e tipos de células, incluindo os astrócitos maduros e os neurónios. No entanto, o método tradicional de loacélulas D com cálcio indicador corante (ou seja, carga banho) não foi eficiente no carregamento de todos os tipos de células SVZ. De facto, a densidade celular no SVZ impede a difusão do corante dentro do tecido. Além disso, a preparação de cortes sagitais será melhor preservar o arranjo tridimensional de culas SVZ, particularmente o fluxo de migração dos neuroblastos no eixo rostral-caudal.

Aqui, descrevemos métodos para preparar secções sagitais contendo o SVZ, o carregamento de culas SVZ com corante indicador de cálcio, e a aquisição da actividade de cálcio com lapso de tempo a filmes. Utilizou-Fluo-04:00 corante de carregamento astrócitos SVZ usando a aplicação de pressão no interior do tecido. Atividade de cálcio foi gravado utilizando um microscópio de varredura confocal permitindo uma resolução precisa para distinguir células individuais. A nossa abordagem é aplicável a outras zonas de origem neural, incluindo a zona do hipocampo adulto subgranular embrionárias e as zonas de origem neural. Além disso, outros tipos de corantes podeser aplicado utilizando o método descrito.

Protocolo

1. Preparação de Soluções, dissecação, e Vibratome

1. As soluções devem ser preparadas no osmolaridade correta e pH (Tabela 1). Comparado com fluido cerebrospinal artificial (ACSF), solução de dissecção é preparado com menores concentrações de sódio e de cálcio, e as concentrações mais elevadas de magnésio. Isto é para minimizar os efeitos de excitotoxicidade, durante o corte.
2. Ambas as soluções de dissecção e ACSF deve estar saturado com _95% O2 / 5% de CO ₂ por borbulhamento durante pelo menos 10 minutos para atingir o pH desejado de 7,3.
3. Preparar um banho de gelo em uma bandeja. Colocar uma placa de dissecação no banho de gelo e encher com solução de dissecção. Bolha da placa de dissecação.
4. Prepare o vibratome criando um banho de gelo. Coloque o recipiente de corte, em banho de gelo, encher a placa com solução de dissecção, e bolhas.
5. Preencha a fatia segurando câmara com ACSF e bolha para garantir que a solução é uma aeração, independentementede onde pedaços são colocados.

2. Remoção do Tecido Cerebral

Fatias cerebrais agudas tendem a ser mais saudáveis ​​com ratos mais jovens. Arquitetura celular do SVZ pós-natal em roedores é maduro por volta do dia pós-natal (P) 20 ^1. Por isso, tentamos limitar nossas experiências para idades rato da P20-P30, mas temos realizado experiências bem sucedidas em camundongos mais velho que 3 meses. Durante todo o manuseamento do tecido, deve-se ter o cuidado de minimizar movimentos mecânicos e de pressão para o cérebro, manter as condições de refrigeração, e expõe o SVZ a solução tão rapidamente quanto possível sacrifício seguinte.

1. Após a injeção de pentobarbital, o mouse é rapidamente decapitado. A pele é removida e são feitas incisões através da base do crânio. A cabeça é então colocado num tabuleiro cheio com solução de dissecção.
2. Enquanto a estabilização da cabeça com uma pinça, cortes contínuos são feitas em torno do crânio e às vezes até a linha média com Microscissors. Tenha cuidado para minimizar o contato com o tecido. Desde o bulbo olfativo é o destino final de neurônios do SVZ, deve-se estar consciente de preservar essa região, especialmente durante a remoção do osso em torno desta área. Cortes Microscissor feitos em torno do crânio deve estar no lado dorsal, para permitir a fácil remoção do crânio.
3. A remoção do crânio que cobre o cérebro está agora separada do osso por debaixo do cérebro. Se os cortes na etapa anterior são feitas corretamente, este osso sobrejacente pode ser facilmente removido com uma pinça ou fórceps.
4. Continuando a manter a cabeça com uma pinça, pode-se utilizar uma lâmina cirúrgica para remover de forma limpa várias peças de tecido do cérebro anterior de corte, tais como as seguintes. Um corte coronal pode ser feita ao nível do lambda. Cortes sagitais podem ser feitas em ambos os lados do cérebro lateral à SVZ. Uma estimativa conservadora seria ~ 2,5 mm da linha média. Se desejado, o cérebro pode também ser hemisected aqui. Estes cortes serão ambos facillite montagem do tecido e permitir que o SVZ a ser alcançado mais rapidamente, quando o corte do cérebro. É importante lembrar que exercem a quantidade mínima de forças mecânicas sobre o cérebro (por exemplo, não empurrando ou puxando).

3. Preparação Slice aguda Cérebro

1. Para se preparar para as etapas subsequentes, assegurar que a super-cola usada para montar o tecido está livre de obstruções e pronto a ser aplicado à placa de vibratome. É importante ir tão rápido quanto possível, sem danificar o cérebro.
2. O tecido do cérebro pode então ser esvaziado por baixo, o que separa o tecido do osso subjacente ao mesmo tempo que separa os nervos.
3. O tecido é montada e colada sobre uma placa e colocadas no vibratome. Devido à anatomia do rostro-caudal da SVZ, temos focado em fazer cortes sagitais em que preserva a via migratória de neuroblastos, a bainha da glia, e a vasculatura que são em grande medida alinhadas neste sentido. Um pode mount o tecido na linha média ou sobre a superfície plana criado fazendo cortes sagitais laterais ao SVZ. Um passo opcional é colocar um bloco de 3% de agarose por trás do tecido para servir como um encosto para a lâmina como as fatias de sair. Nós preferencialmente utilizados cianoacrilato cola à base de super.
4. Enxaguar a lâmina com etanol para remover óleos e lavar com água destilada. Colocar a lâmina sobre o suporte da lâmina. Monte o suporte da lâmina para o vibratome.
5. Ajustar as definições Vibratome para cortar o tecido com uma espessura de 250-350 mM por fatia. É importante para cortar utilizando vibrações de alta frequência e baixa velocidade.
6. Secção progressivamente através do tecido. A aparência do bolbo olfactivo é um bom indicador de que se está perto do SVZ em cortes sagitais como as fatias mais laterais irá conter nem a região. Outros marcos de olhar para incluir o ventrículo eo espessamento do corpo caloso, sob o qual o SVZ está localizado. A SVZ aparecerá primeiro em mais sagit lateraisfatias mentais. O RMS vai mostrar em medial cortes sagitais.
7. Remover fatias contendo o SVZ com uma pipeta de Pasteur de plástico com ponta cortada. Transferindo-se para a câmara de realização fatia. Nós muitas vezes obter mais fatias do que podemos usar em um dia de trabalho. No entanto, as fatias irá variar a quantidade de células que contenham a SVZ. Por vezes, é necessário olhar através de várias fatias de encontrar um desejado para a imagem latente.

4. Preparação de microscópio e Corantes

As fatias de exigir um tempo de incubação de uma hora em ACSF a recuperar da dissecção e corte. Várias etapas podem ser realizadas durante este período de recuperação de fatia.

1. Preparação de pipetas para a tintura de cálcio e / ou a aplicação de drogas
   1. Pipetas de vidro precisam de ter uma ponta de 2-3 um de diâmetro e um comprimento de ponta (~ 2 mm) eo ângulo (~ 16 ° para o detentor pipeta) que evita o contacto com a câmara de perfusão e permite espaço para a colocação deo objetivo.
   2. Pode-se preparar tipicamente 6-8 pipetas de pressão para cada dia de experiências.
2. Preparação corante cálcio
   1. Quando se prepara a solução de trabalho (4-5 uM de banho, 250 uM por aplicação de pressão), é melhor para expor a quantidade mínima de DMSO para as células. Isto pode ser conseguido, fazendo stocks altamente concentradas. Por exemplo, para Fluo-4, um tubo contendo 50 ug por dia é utilizada. Pode-se fazer um estoque de 10 mM de esta aliquota por adição de 4,6 uL de solução de Pluronic F-127 a 20% em DMSO.
3. Preparando a configuração microscópio (Figura 2).
   1. A utilização de uma bomba peristáltica, para o fluxo de solução tem ajudado a minimizar o desvio da imagem. Fazer funcionar a bomba peristáltica antes de permitir ACSF a correr através das linhas de perfusão e de assegurar que seja livre de bolhas.
   2. Defina a entrada do tubo na câmara de perfusão e garantir que não haja vazamentos.
   3. Posicione a ponta de vácuo para ensgurar que a solução está a ser aspirada a partir da câmara de perfusão. Garantir que ele está em um nível adequado para que o objetivo está imerso a uma distância adequada de trabalho, mas não tão alto como solução que pode transbordar da câmara. Um nível baixo de solução também irá minimizar as distorções de fluxo. A aspiração constante também pode ser verificada por escuta para estabilidade.

5. Carregando Dye

Este método tem sido descrito em detalhe em outro manuscrito ^2. Por favor, veja as figuras nele.

1. Corante de carga de banho
   1. Prepare uma solução de trabalho 1-2 ml do corante. Para Fluo-4 AM, uma concentração de 4-5 mM é adequado para etiquetar neuroblastos SVZ.
   2. Fatias são primeiramente transferidos para uma placa de cultura de 35 mm com uma parte inferior de malha que já está preenchida com ACSF. Substituir a solução por meio de uma pipeta de transferência de 3 ml de plástico para remover suavemente a ACSF e, simultaneamente, adicionando a calcium corante de solução de trabalho.
   3. Incubar a 37 ° C durante 30-60 min num ambiente de 5% de CO ₂ do gás controlada.
   4. Colocar a fatia de volta para a câmara cheia de ACSF segurando para lavar corante que não tenha entrado células. Alternativamente, pode-se colocá-lo directamente na câmara de perfusão microscópio que está a executar ACSF. Este período de lavagem de 30-45 minutos.
   5. Transferir a fatia para a câmara de perfusão.
2. A aplicação da pressão de corante
   1. Transferir a fatia a partir da câmara de retenção para a câmara de perfusão da configuração microscópio.
   2. Encha uma pipeta de vidro com uma solução de trabalho que é de 250 uM e local sobre o micromanipulador.
   3. Diminuir a pipeta para a região de interesse. A pipeta pode ser colocada de tal modo que a ponta é ou vários micrómetros acima da superfície da fatia ou vários micrômetros enterrado abaixo da superfície da fatia, mas longe da região gravada. O ângulo da pipeta não Affect a eficiência de carga. Quando imagem abaixo da superfície da fatia, descobrimos que colocar a ponta da pipeta abaixo do plano de imagem irá rotular nossa área de imagem desejada melhor.
   4. Quando a pressão de aplicação do corante, defina a Picospritzer de modo que é <3 psi. Não foram estimar o volume de difusão do corante, porque este é sujeito a variabilidade do diâmetro da ponta da pipeta, a pressão aplicada e a densidade do tecido, onde o corante é injectado. Nós simplesmente aplicar até alcançarmos nossa carga desejado, tal como avaliado por olho. Minimizar os danos para a fatia durante a aplicação, especialmente quando a extremidade é colocada por baixo da superfície de corte. Aplicar por 1-2 min. Às vezes repetidas aplicações são necessárias dependendo rotulagem avaliada por olho. Para esta aplicação e duração de concentração, descobrimos que a aplicação superficial de corante preferencialmente rotula neuroblastos enquanto abaixo da superfície de aplicação, preferencialmente, rotula astrócitos. No entanto,> aplicação min 3 a 500 uM também irá etiquetar neuroblastosindependentemente do facto de a ponta está acima ou abaixo da superfície da fatia (JC Platel, observação não publicada). Permitir a lavagem e recuperação fatia por 30-45 min.

6. Imagem confocal de Atividade de cálcio

1. Encontrar a região de interesse pela primeira vez com um objetivo de baixo consumo, como 4x ou 10x. Coloque no centro do campo antes de mudar para um objetivo maior potência. Neste ponto, pode-se avaliar a saúde geral fatia notando o aparecimento de células SVZ sob contraste de interferência diferencial (DIC). As células saudáveis ​​aparecem rodada e gordo. Além disso, as células saudáveis ​​que exibem fraca Fluo-4 carregamento como suposto nenhuma carga na fluorescência total ou brilhante (uma célula a morrer).
2. Abaixe o objetivo imersão em água para a região de interesse, que agora é corante-carregado. Ou um objectivo 40x ou 60x tem sido adequado para as nossas necessidades, apesar de 40x proporciona um maior campo de visão e permite um acesso maior pipeta. Quando abaixo da imagiologiasuperfície, que muitas vezes passam pelo menos 15 mm abaixo da superfície da fatia onde a arquitetura 3-dimensional e saúde célula são melhor preservados.
3. Verifique se a perfusão e vácuo estão trabalhando adequadamente.
4. Configurar o microscópio para que a resolução de lapso de tempo e resolução espacial são definidas para as taxas desejadas. Para a microscopia confocal, estes factores devem ser equilibradas, como um aumento da resolução temporal geralmente resulta em uma perda de resolução espacial devido à natureza do sistema de digitalização. Para a atividade de cálcio, nós ter imaginado um quadro de aproximadamente a cada segundo com uma resolução de pixel 512x512. Se múltiplos canais adquiridos separadamente são necessárias, isso também vai afetar as taxas de aquisição. Definir a duração do filme (2-10 min).
5. Iniciado executado. Se realizar estudos farmacológicos, lave em antagonistas ou não dessensibilizantes agonistas por pelo menos 5-10 minutos, e depois fazer outro filme de 5-10 min. Agonistas que podem dessensibilizar os receptores podem ser aplicadas de forma aguda, por exemplo, usando um prEssure pipeta controlada por um micromanipulador.

7. Análise de cálcio

Análise segue os procedimentos padrão que se descritos nas publicações permeáveis ^​​2-4. F ₀ (linha de base, por exemplo) e F são as intensidades de fluorescência médios medidos ao longo de todas as regiões de interesse (ROI) e em cada uma ROI, respectivamente. A alteração de fluorescência foi considerado como sendo um aumento ^de Ca2 ⁺ se foi> 15% F / F aumento _0. Intracelulares de Ca ^{2 +} variações foram calculadas utilizando Calsignal ^5.

8. Resultados representativos

Fomos capazes de obter carga selectiva de células SVZ dependendo dos protocolos de carga de corante descrito acima e noutros locais ^2-4,6. Carregamento banho ou a aplicação de pressão sobre a superfície da fatia de Fluo-4 AM (4-5 ou 250 uM, respectivamente) na sua maioria etiquetas neuroblastos. Embora a aplicação de pressão pode carregar neurobdura mais rapidamente do que o carregamento banho em uma única fatia, carregamento banho permite o carregamento simultâneo de várias fatias. Confirmamos a identidade de células marcadas como neuroblastos por (1) se eles exibem um comportamento migratório ^4,7, (2) a sua morfologia, (3) coloração negativa de sulforrodamina 101, um corante específico dos ^{astrócitos-3} ou (4), com coloração positiva DCX-DsRed expressão (JC Platel, observação não publicada). Neuroblastos migrar rapidamente (média de 60 um / h) a temperatura fisiológica ^4,7-9, mas o seu movimento pode ser facilmente observada mesmo à temperatura ambiente. O movimento de neuroblastos não representar um problema com relação à colocação de regiões de interesse (ROI) para controlar a atividade de cálcio uma vez que nossos filmes são geralmente de curta duração. No entanto, durante longos períodos de espera, como durante os intercâmbios de soluções de drogas, os investigadores devem ter o cuidado de combinar ROIs no controle e períodos de tratamento. Não é incomum para neuroblastos para migrar para dentro ou para fora do i maging campo ou plano focal.

A aplicação da pressão de Fluo-4 AM (250 M) em profundidade a fatia e de duração limitada (<2 min) preferencialmente rotula astrócitos SVZ ^2. Rotulagem astrócito foi verificada por meio de rotulagem positiva com sulforrodamina 101 e a sua morfologia, principalmente pela presença de projecções e endfeet sobre os vasos sanguíneos que foram recentemente descritas ^3. Usando estes métodos, temos observado actividade espontânea em ambos os neuroblastos SVZ e população de astrócitos (Figura 1). A atividade em astrócitos muitas vezes toma a forma de ondas que se dedicam ³ vaso sanguíneo. Além disso, utilizando imagiologia de cálcio como um ensaio, a aplicação de agonistas farmacológicos revelou ou confirmou a expressão de receptores GABA _A de neuroblastos e astrócitos ^6, os receptores AMPA e NMDA em neuroblastos ^4.

Figuras

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Figura 1. Propagação da atividade de cálcio em astrócitos. (A) Representante média imagem de uma gravação de lapso de tempo de atividade de cálcio. Os astrócitos do SVZ foram carregadas com a aplicação da pressão de Fluo-4:00 profundamente na fatia. Filmes foram adquiridos a 0,75 s de tempo-passos. As regiões de interesse (ROI) são colocados sobre as células que exibem actividade. (B) Vestígios de ROIs colocados sobre as células do filme descrito em (A). Traços foram filtrados com uma média móvel e normalizado. A escala vertical representa 2 x Af / F ₀ onde F é a intensidade de sinal e F ₀ é o sinal de linha de base média e Af = FF _0.

Figura 2. Imagem do sistema de perfusão. Uma extremidade de um tubo está submersa em _95% de O2 / 5% de CO ₂ gás-perfused solução. A solução é então perfundido através do tubo e para a câmara de banho através de uma bomba peristáltica (não mostrada). A outra extremidade está inserida dentro da entrada da câmara de solução de banho montado sobre uma plataforma. A ponta de aspiração é então ligado à tomada de solução da câmara, e fixado a um nível para determinar a altura da solução. Da tomada, a ponta de aspiração está ligado à linha de vácuo, que aspira a solução a partir da câmara para um recipiente de resíduos. O sistema de perfusão é mostrada fora da platina do microscópio para claridade visual.

Discussão

Imagiologia de cálcio de células SVZ tem sido utilizada para estudar os padrões de actividade espontânea em ¹⁰ neuroblastos, expressão de receptores de canal em ambos os neuroblastos e astrócitos ^4,6,8 e ondas de cálcio astrocíticos ^3. Uma vez que as células no SVZ ou são imaturos ou têm propriedades gliais, eles não são acionados acção potenciais ^11,12, o que significa que alterações no potencial de voltagem milissegundo indicativos de actividade em redes mad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluto	Companhia	Número de catálogo	Dissecção (mM)
Sacarose	Sigma	S0389	Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM
NaCl	Sigma	S9888	Dissecção: 42 mm ACSF: 126 mM
KCl	Sigma	P3911	Dissection: 2,5 mM ACSF: 2,5 mM
MgCl 2 .6 H 2 O	Sigma	M9272	Dissecção: 4,33 mM ACSF: 1 mM
NaH 2 PO 4. H 2 O	Sigma	S8282	Dissection: 1,25 mM ACSF: 1,25 mM
Glicose	Sigma	G8270	Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM
NaHCO3	Sigma	S6014	Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM
CaCl 2 .2 H 2 O	Sigma	C3306	Dissection: 1,33 mM ACSF: 2 mM

			[Header]
Nome	Companhia	Número de Catálogo	Comentários
Vibratome	Leica	VT 1000S
Super Glue	Surehold ou 3M	Surehold 3G Super Cola ou 3M Vet-Bond
Instrumentos de dissecação	Roboz ou Ted Pella
Fluo-04:00 cálcio-corante sensível	Invitrogen	F14201
Verde Oregon-BAPTA 01:00 cálcio-corante sensível	Invitrogen	O6807
Solução de Pluronic F-127 a 20% em DMSO	Invitrogen	P3000MP
Microscópio confocal vertical	Olimpo	FV300 ou FV1000
Imersão em água objetivos	Olimpo	LUMPlanFl 40 x W / IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 x W / I (NA 0,90)
Micromanipuladores	Sutter	MPC-200/MPC-325/MPC-385
	Parker Hannifin	Picospritzer	<3 PSI durante a aplicação
Pipeta extrator	Sutter ou Narshige	Sutter P-97 ou Narshige PP-830
Pipetas de vidro	Sutter	BF150-110-10	ID: 1,10, OD: 1,50
Bomba peristáltica	Harvard Apparatus	Modelo 720	taxa de fluxo: 1 ml / min
Banho de Câmara	Warner Instruments	RC-26 GLP	De baixo perfil permite folga objetivo
Tubulação	Tygon
Controlador de temperatura	Warner Instruments	TC-324B/344B