Engenharia bactérias aderentes pela criação de um único sintético Curli Operon

Resumo

A concepção de um operão que codifica tanto o aparelho sintético de secreção e os monómeros estruturais de curli fibras é descrito. A superprodução destas amilóides e polímeros aderentes permite um ganho mensurável de aderência do E. coli Chassis ¹. Maneiras fáceis de visualizar e quantificar a adesão são explicados.

Resumo

O método descrito aqui consiste em redesenhar E. coli propriedades de aderência através da montagem do número mínimo de genes curli sob o controlo de um promotor forte e metal overinducible-, e em visualizar e quantificar o ganho de aderência bacteriana. Este método aplica-se princípios de engenharia adequadas de abstração e padronização da biologia sintética, e resultados no biotijolo BBa_K540000 (dispositivo Melhor biotijolo novo e projetado, iGEM 2011).

O primeiro passo consiste na concepção do operão sintético dedicada à superprodução curli em resposta a metal, e, portanto, para aumentar a capacidade de aderência da estirpe de tipo selvagem. O original foi modificado curli operon in silico, a fim de otimizar os sinais de transcrição e tradução e escapar da regulação "natural" de curli. Esta abordagem permitiu testar com sucesso a nossa compreensão atual da produção curli. Moreover, simplificando a regulação curli trocando o promotor endógeno complexo (mais de 10 identificados reguladores transcricionais) de um promotor de metal-regulada simples torna aderência muito mais fácil de controlar.

A segunda etapa inclui a avaliação qualitativa e quantitativa das habilidades de aderência por aplicação de métodos simples. Estes métodos são aplicáveis ​​a uma ampla gama de bactérias aderentes independentemente das estruturas biológicas envolvidas na formação de biofilme. Teste de aderência em placas de 24 poços de poliestireno proporciona uma visualização rápida preliminar do biofilme bacteriano após coloração com violeta de cristal. Este teste qualitativo pode ser afiada, mediante a quantificação da percentagem de aderência. Tal método é muito simples, mas mais preciso do que a coloração violeta de cristal único, como descrito anteriormente, com ^um tanto uma boa repetibilidade e reprodutibilidade. Visualização de bactérias marcadas com GFP em lâminas de vidro por fluorescência a laser ou confmicroscopia ocal permite reforçar os resultados obtidos com o teste de placa de 24 poços por observação directa do fenómeno.

Introdução

A aderência bacteriana ao suporte abiótico desempenha um papel importante em células de combustível biocatálise biorremediação, ou microbiana. Processos de biorremediação utilizar as capacidades dos microorganismos para degradar as substâncias orgânicas, ou para modificar a distribuição de metal (volatilização imobilização) ou especiação. Essas atividades benéficos são observados em ecossistemas aquáticos e terrestres, mas também nos sistemas artificiais desenvolvidos para tratar a água poluída de resíduos industriais e domésticos. A intensidade e a qualidade da actividade microbiana dependem factores físico-químicas, mas também sobre o estilo de vida dos microrganismos (flutuante ou incorporado em biofilme). A formação de biofilme está associada a um metabolismo, resistência a biocidas, por diversos mecanismos. Este fenômeno, portanto, ser incentivado na maioria dos processos de biorremediação. Além disso, as células de engenharia de Escherichia coli para controlar a formação de biofilme tem sido aplicado com sucessoimobilizar células inteiras sensores em biochips ^2-3.

Adaptação dos microrganismos a uma elevada concentração de metais ocorre por meio de diversos mecanismos, tais como a adsorção aos componentes da matriz extracelular, a activação da bomba de efluxo ou transportadores específicos capazes de concentrar o metal para dentro da célula. Impulsionando estas actividades bacterianas através da engenharia genética permite o tratamento eficaz e barata de poluição de metal, à escala laboratorial, em especial no caso de metais altamente tóxicos em quantidade fraca, tal como descrito por Raghu et al. 2008 ^4. Descontaminação bacteriana representa, neste caso, um método de poupança competitivos e de custo em comparação com os processos químicos clássicos, usando resinas de permuta iónica. Os autores descreveram uma E. chassis coli geneticamente modificada para a absorção e retenção de cobalto primeiro batendo para fora da bomba de efluxo de codificação do gene rcnA, e, em seguida, através de transformação com uma cópia múltipla a superprodução de um plasmídeo que permitatransportador com a absorção preferencial de cobalto. tal estirpe surge como uma alternativa eficiente para resinas de permuta iónica para o tratamento de efluentes radioactivos, mas um problema por resolver é a recuperação de bactérias contaminados no final do processo ^4. O objetivo do nosso trabalho foi, portanto, de projetar uma cepa de design personalizado capaz de furar a suportes abióticos, como vidro ou plástico.

Entre o conjunto de adesinas e as fímbrias aderentes identificadas em bactérias Gram-, optamos por projetar um sistema que permita a produção curli. Curli são fibras amilóides finas (2-5 mm de diâmetro) e altamente agregadora que se projetam a partir do E. coli e Salmonella de superfície como uma matriz não cristalina e insolúveis ^5-7. Curli também estão envolvidos na colonização de superfícies abióticas e para o desenvolvimento de biofilmes ^8. Curli foram recentemente mostrado para ligar iões de mercúrio ^9. Amilóides são de facto conhecidos por possuir altaafinidade por íons metálicos como Cu ^{2 +,} Zn ^{2 +} e Fe ^{3 + 10.} Essa propriedade pode melhorar ainda mais a descontaminação de metais de efluentes poluídos. O cluster csg é responsável pela produção de fibras curli e é constituído por dois operões divergentemente transcritos (Figura 1). O CSGB, csgA e genes csgC constituem o operão sentido, que codifica as duas subunidades, curli CsgA e CSGB. CsgC parece ser envolvidos na atividade redox dentro do sistema biogênese curli e afetar o comportamento dos poros CsgG ^11. No entanto, a ausência de csgC na maioria dos curli bactérias produtoras indica que a proteína correspondente fornece apenas um nível secundário de controlo sobre a biogénese curli. Para simplificar o sistema, foram escolhidos para trabalhar com o número mínimo de genes.

O csgDEFG operonencodes proteínas essenciais na regulação e transportede CsgA CSGB e para a superfície da célula. CsgD é um activador da transcrição do operão csgBAC e desempenha um papel fundamental no controlo da formação de biofilme, controlando a produção de fímbrias curli e componentes de biofilme, tais como a celulose ¹² e inibindo a produção flagelo ^13. CSGE, CsgF CsgG e constituem um aparelho secretor curli específicos na membrana exterior, através da qual a grande subunidade de proteína curli CsgA é segregada como uma proteína solúvel. A polimerização de CsgA é dependente in vivo sobre a ligada à membrana da proteína nucleador CSGB (revisto em ^14). Complexos envolvendo várias vias reguladoras de dois componentes de sistemas têm sido mostrados para controlar a expressão do gene curli ^15-16. Estes regulamentos complexos permitem que as bactérias formam biofilmes grossas através da produção curli em resposta a sugestões ambientais, mas são difíceis de controlar para aplicações industriais. Para facilitar a recuperação da metal-enchido bactérias durante um processo industrial, a fixação das bactérias a um suporte sólido, de facto tem de ser controlado pelo parâmetro bem definido (s). As propriedades aderentes da curli estão ligados à sua natureza amilóide ¹⁷ e poderiam ser utilizados para melhorar os processos de biorremediação, mas um dispositivo simples e facilmente controlada tem de ser criado.

Entre estes genes 7 ^18, um conjunto de 5 absolutamente necessário genes para a síntese de curli (CSGB e monómeros de fibra csgA de codificação) e exportação (CSGE csgF e csgG, que codifica o complexo de secreção curli) foram seleccionados para construir o operão sintético. Para escapar à regulação "natural" de curli, um operão sintético compreendendo esses genes CSG 5 sob o controlo de um promotor forte e overinducible-cobalto (Figura 2) foi desenhado e sintetizado. A análise passo-a-passo da região de codificação de curli e o procedimento para a criação de um syn funcionaltético operão são descritos. Dois métodos para visualizar e quantificar a aderência bacteriana ao poliestireno e vidro são explicados.

Protocolo

1. Biotijolo Design e Síntese do Operon Curli

1. Determinar a organização genética e localizar os sinais endógenos de transcrição e tradução dos genes curli. Estas informações são recolhidas em bancos de dados especializados, como RegulonDB ^um ou EcoGene ^b e completado por uma leitura cuidadosa das publicações pertinentes. Gestão de dados e em preanalysis silico foram realizados com Clone Gestor de software ^c.
2. Selecionar as seqüências de codificação pertinentes. Um conjunto de cinco genes absolutamente necessários para a síntese curli (CSGB e monómeros de fibra csgA de codificação) e exportação (CSGE csgF e csgG, que codifica o complexo de secreção Curlin) foram seleccionados para construir o operão sintético. Extrair as sequências escolhidas a partir da base de dados no formato FASTA.
   À medida que o aglomerado é csgGFE antisense em E. genoma coli, converter esta sequência para o seu complemento inverso counterparte usando as ferramentas Clone Operations Manager> molécula de Processo> Inverter molécula. Cole a seqüência csgEFG trás csgBA usando a função "ligadura" (Clone> ligadura).
3. Adicionar o promotor apropriado. Ao colocar os cinco genes selecionados curli sob o controlo do promotor P rcn, curli são previstos para ser sobre-produzido na presença de cobalto e níquel. O locus rcn codifica uma bomba de efluxo responsável por Ni e Co desintoxicação (rcnA) e seu cognato metalo-regulador (rcnR). RcnR controla a expressão de rcnA e seu próprio gene em resposta a Ni e Co ^19. A sequência compreendendo rcn CDS rcnR, a região intergénica rcn inteiro mais os 41 primeiros nucleótidos rcnA foi placedin frente da sequência csgBAEFG quimérica (Figura 1, a sequência do construto inteiro é fornecido como os dados suplementares).
4. Otimizar o transcricionalsinais. Um sítio de ligação ao ribossoma perfeita (ou perfeito RBS = AAGGAGGTATATA) foi adicionado na frente do primeiro ATG da sequência de DNA csgBA. Um segundo RBS perfeito foi adicionado na frente da sequência de csgEFG. RBS endógeno para o CSGB e genes csgF e csgG foram conservados.
5. Para ajustar as normas iGEM, o dispositivo deve ser acompanhada por um prefixo e sufixo biotijolo padrão, contendo sítios de restrição para EcoRI, Pst I (prefixo) e Spe e Xbal (sufixo). Colar as sequências correspondentes em cada extremidade do dispositivo ^d.
6. Eliminar qualquer Eco RI, Pst I, Spe I e Xba I no sítio de reconhecimento do dispositivo. Para facilitar o processo de montagem adicional, a parte biotijolo si não pode conter qualquer um destes sítios de restrição. In silico análise de restrição do dispositivo revelou um local Pst I na sequência csgA, um local Pst I na sequência rcnRe um local EcoRI no gene CSGE. Estes locais são, respectivamente, localizados em posição 80 (Mut1), 1340 (Mut2) e 1830 (Mut3) da sequência de dispositivos (dados adicionais) e foram modificadas como se segue por mutações silenciosas.
   Mut1 Pst I CTGCAG local alterado no CGTCTG
   Mut2 Pst I CTGCAG local alterado no CAGCAG
   Mut3 GAATTC sítio Eco RI mudado em GAATT
7. Executar através da simulação de tradução usando o software Gerenciador de Clone (> Operação moléculas de processo> moléculas de traduzir). Usar a sequência de programa de alinhamento BLAST para verificar a homologia perfeita entre o tipo selvagem de proteínas curli e as proteínas codificadas pelo operão sintético.
8. Peça o operon sintético. Serviços comerciais de síntese de genes estão disponíveis a partir de inúmeras empresas em todo o mundo, o nosso parceiro foi Genecust (Luxemburgo). 4 ug do operão artificial (3165 pb) foram recebidos semanas mais tarde e inserido em pUC57 (pIG2).

2. Visualizar e quantificar bactérias aderentes em poliestireno

1. Encher cada poço de uma placa de poliestireno com 24 cavidades com 2 ml de meio mínimo M63 (glucose a 0,2%) e inocular cada poço com 106 células de uma cultura durante a noite. Crescer as bactérias a 30 ° C, durante 18 a 48 horas sem agitação. Cada coluna (4 poços) representa uma modalidade. Adicionar a quantidade adequada de cobalto (25 a 100 mM) e antibióticos (ampicilina 100 ^gL-1), quando necessário. As três primeiras linhas da placa de 24 cavidades são usadas para quantificar as bactérias aderentes através da média das três repetições, do lado esquerdo da última linha é utilizada para visualizar o biofilme.
2. Para as três primeiras filas da placa de 24 poços: para cada poço, recuperar o sobrenadante que contém as células planctônicas.
3. Lavar cuidadosamente cada poço com 1 ml de M63 e a piscina de lavagem com 1 ml do sobrenadante inicial obtido em 2.2). Este conjunto é referido como células de natação (= S).
4. Recuperar o biofilme em 1 ml of M63 por raspagem e pipetando para cima e para baixo (= B). Vortex 15 seg. Estimativa do número de bactérias na superfície anexas e nadar a partir da densidade óptica a 600 nm (OD600) para dar a percentagem de adesão correspondente a cada uma das modalidades.
5. A percentagem de aderência é calculada utilizando a fórmula: BX100 / (3xs + B).
6. Apenas para a última linha da placa de 24 poços: descartar células planctônicas.
7. Enxaguar com 1 ml de M63 o biofilme que se desenvolveu sobre a parte inferior da placa.
8. Secar a placa aberta, durante 1 hora a 80 ° C.
9. Adicionar 100 ul de violeta de cristal a 20% durante 2 minutos, em cada poço seguido por lavagens extensas com água para visualizar as bactérias da superfície inscritos.
   Três ensaios independentes (placas) devem ser realizados para garantir a reprodutibilidade.

3. Visualize bactérias aderentes no vidro por Microscopia

1. Obter um chassi fluorescente. O E. coli estirpe ^e que SCC1 constitutively expressa a proteína verde fluorescente (GFP) com nenhuma diferença observável a partir da estirpe MG1655-mãe ²⁰ é um hospedeiro adequado para o rolamento do plasmídeo sintético curli operon.
2. Transformar SCC1 com o plasmídeo pIG2 (= sintético curli operon inserido no EcoRI / PstI local do plasmídeo pUC57) para se obter a estirpe S23. Transformar SCC1 com um plasmídeo de controlo (pUC18) para se obter a estirpe de controlo S24 ^21.
3. Crescer durante a noite precultura do S23 e do controlo (S24) estirpes a 30 ° C em meio M63 suplementado com glucose (0,2%) e ampicilina (100 ^gL-1).
4. Inocular 15 ml do mesmo meio, em placas de Petri com 100 ul da pré-culturas. Adicionar a concentração adequada de cobalto (isto é, 25 M) e não se esqueça do controle negativo sem cobalto. Apresente três lamela de vidro retangular em cada placa de Petri. Incubar durante a noite a 30 ° C sem agitação.
5. Retirar as lamelas from prato Petri e cuidadosamente drená-lo. Limpe cuidadosamente a parte inferior do rosto com um material de algodão pequena impregnada com etanol a 70 °, limpando fora de cada resíduo bacteriana. Para a observação confocal, limpar ambas as extremidades superiores em alguns milímetros para possibilitar a fixação adicional da lamela.
6. Bactérias aderentes pode ser visualizado directamente, mas rapidamente sob o microscópio de fluorescência, mas cuidadosamente evitar a secagem da amostra.
7. Para a observação confocal, depositar a lamela numa lâmina de vidro com a face superior coberta pelo biofilme colocada com a face para cima. O biofilme é então coberta com uma lamela de maior, a qual é fixada à lâmina de vidro com verniz. Inverta a configuração de modo a que o biofilme será agora na face inferior.
8. Coloque a configuração sob o microscópio confocal a laser. Um direito Axioplan2 LSM510 (Zeiss) microscópio confocal a laser foi usado no ^f plataforma Platim.
9. Definir. GFP excitar a 488 nm, e recolher a fluorescência bacteriana no intervalo 500-600 nm . Use objetiva de imersão 40x óleo para a aquisição de imagens em modo de varredura a laser confocal. Digitalizar os totais estruturas tridimensionais dos biofilmes da superfície sólida para a interface com o meio de crescimento, utilizando um passo de 1 um.
10. Realizar projecções tridimensionais com IMARIS software (bitplane, Zurique, Suíça). Determinar a espessura do biofilme por meio da análise do valor médio ao longo de z estatísticos secções longitudinais. Quantificação de biovolumes biofilme pode ser extraído a partir de confocal z pilhas como descrito em outro lugar ^22.

^um RegulonDB fornece informações sobre mecanicista operon organização e a sua decomposição em unidades de transcrição, promotores e seu tipo sigma, os genes e os seus locais de ligação ao ribossoma, terminadores, sítios de ligação dos reguladores transcricionais específicos, bem como a sua organização em frases de regulação.et = "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp

^b O banco de dados EcoGene contém informações atualizadas sobre o E. coli K-12 genoma e proteoma, incluindo seqüências de genes extensas bibliografias. Um foco EcoGene principal foi a reavaliação dos locais de início de tradução. http://ecogene.org/

^c http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm

^d http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix

^e Gift of Chun Chau Sze, Nan Yang Technical University, de Cingapura.

^f Platim microscópica plataforma UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.

Resultados

In silico anotação da seqüência tipo selvagem csg de E. coli K12 associadas com a optimização de sinais de transcrição e de tradução, permitiu conceber o único sintético curli operon P-rcn csg mostrado na Figura 3 (a sequência completa de dados suplementares). Protocolo 2 e 3 do protocolo foram usadas para visualizar e quantificar a aderência associada com a produção curli. Utilizando coloração de violeta de cristal em placas de 24 poços de poliesti...

Discussão

Etapas críticas

O passo mais crítico nesta abordagem de biologia sintética é o design gene. Projeto gene sintético tem que ser meticuloso para assegurar um sistema de produção eficiente. Dois genes que codificam para os monómeros de fibra e três genes que codificam para proteínas envolvidas no seu sistema de secreção foram montados com um promotor forte e indutivel de metal para criar uma nova unidade funcional para uma aplicação nova: a bio-descontaminação de efluentes nuclear....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
pIG2			pUC57 (pMB1 ori, 2710 bp) com um fragmento EcoRI de 3165 pb / PstI contendo o sintético P rcn - csgBAEFG operão; Ampr
pUC18			Multicópia plasmídeo (pMB1 ori, 2686 pb), Amp r
S23			SSC1 (= GFP-tagged MG1655, dom de Sze CC) / pIG2
S24			SSC1/pUC18
CoCl2	Sigma		Solução 0,1 M de ações mantidas em temperatura ambiente
M63			29
Placa de 24 poços	Nunc	55429	De poliestireno de 24 poços