Isolamento dos núcleos dos cardiomiócitos a partir de Post-mortem de tecidos

Resumo

Núcleos cardíaca são isolados através de sedimentação densidade e immunolabeled com anticorpos contra o material pericentriolar 1 (PCM-1) para identificar e classificar os núcleos dos cardiomiócitos por citometria de fluxo.

Resumo

Identificação de núcleos de cardiomiócitos tem sido um desafio em cortes de tecido como a maioria das estratégias de contar apenas com proteínas marcadoras citoplasmáticos ^1. Eventos raros em miócitos cardíacos, tais como a proliferação e apoptose necessitam de uma identificação precisa dos núcleos dos miócitos cardíacos para analisar a renovação celular e na homeostasia em condições patológicas ^2. Aqui, nós proporcionar um método para isolar a partir de núcleos de cardiomiócitos pós tecido mortem por sedimentação densidade e imunomarcação com anticorpos contra o material pericentriolar 1 (PCM-1) e triagem de citometria de fluxo posterior. Esta estratégia permite uma análise com rendimento elevado e de isolamento, com a vantagem de se trabalhar igualmente bem em tecido fresco e material de arquivo congelado. Isto torna possível estudar o material já recolhidos na biobancos. Esta técnica é aplicável e testado em uma vasta gama de espécies e adequados para várias aplicações tais como a jusante de carbono-14 namoro ^3, a célula-cycle análise ^4, visualização de análogos da timidina (por exemplo, BrdU e UDI) ^4, a análise de transcriptoma e epigenética.

Protocolo

1. Isolamento dos Núcleos Cardiac

1. Revestimento tubos de ultracentrifugação (Tubos centrífuga Beckman # 363664) com 10 ml de solução de revestimento de 1% BSA / PBS. Tapar os tubos e deixá-los girar durante 30 min num rotor tubo. Remover a solução de revestimento e deixar que o tubos de centrifugação de ar seco (um tubo por coração do rato é necessária para a análise de corações de rato individuais, alternadamente até 5 corações de rato ou 1 g de tecido do coração a partir de uma espécie diferente (por exemplo, humanos) podem ser processados em um tubo).
2. Todos os passos seguintes devem ser realizados no gelo. Dissecar o ventrículo esquerdo do coração de rato fresco ou congelado snap-com um bisturi. Nota, este protocolo é optimizado para coração de rato, mas também pode ser adaptado para rato ou do coração humano. Alternativamente, usam-se a 1 g de tecido do coração a partir de uma espécie diferente.
3. Apare o espécime em cubículos pequenos, com um bisturi.
4. Transfira os pedaços de tecido em um tubo Falcon 50 ml cheia com 15 ml de tampão de lise.
5. Homogeneizar atecido do coração com uma T-25 Ultra-Turrax sonda homogeneizador (IKA) com 24.000 rpm durante 10 seg.
6. Diluir o homogeneizado com um volume igual de tampão de lise a 30 ml.
7. Utilizar um vidro douncer (40 ml) para continuar a homogeneizar o tecido e os núcleos livre. Executar oito traçados com um pilão de grande folga.
8. Passe o núcleo bruto isolar através de um 100 mm e 70 mM de nylon de malha de células do filtro (BD Biosciences), consecutivamente.
9. Girar para baixo os núcleos isolado bruto numa centrifugadora refrigerada (4 ° C) a 700 xg durante 10 min.
10. Remover o sobrenadante cuidadosamente por inversão dos tubos e limpar o interior do tubo com uma toalha de papel. Tenha cuidado para não perturbar o pellet núcleos.
11. Dissolve-se o isolado bruto núcleos em 5ml de tampão de sacarose por pipetagem a solução várias vezes para cima e para baixo. Adicionar mais 25 ml de tampão de sacarose para o sedimento dissolvido.
12. Adicionar 10 ml de tampão de sacarose recentemente preparada para o tubo de ultracentrifuga revestido (ver passo 1.1).
13. Cuidadosamente sobrepor a 10 ml adicional de tampão de sacarose, com a ressuspenso núcleos sedimento dissolvido em tampão de sacarose a partir do passo 1.9.
14. Equilibrar os tubos de centrifugação antes de os colocar num rotor JS13.1 livre oscilante e colocar o rotor em uma centrífuga de alta velocidade (Beckman Avanti-S 25).
15. Girar a amostra núcleos em 13.000 xg, a 4 ° C durante 60 min.
16. Quando a rotação foi concluída, remover os tubos cuidadosamente a partir do rotor e descartar o sobrenadante por inversão dos tubos e limpando os detritos remanescente a partir do interior dos tubos com toalha de papel.
17. Dissolve-se o pellet núcleos em 1 ml de tampão de núcleos de armazenamento (NSB mais tampão). Nota: NSB plus contém 1,5 mM espermina na forma de um estabilizador de DNA.
18. Prossiga com o passo 2.1, imunocoloração de núcleos de cardiomiócitos.

2. A imunocoloração para Citometria de Fluxo

1. Prepare o controlo negativo para a imunocoloração. Tomar uma alíquota de 20 uL para fora da amostra núcleos e umadd ul 980 de NSB mais buffer.
2. Adicionar anti-pericentriolar material de um anticorpo (anticorpo de coelho anti-PCM-1, Antibodies Atlas) para a amostra núcleos em uma diluição de 1:500 a immunolabel núcleos de cardiomiócitos. Adicionar o anticorpo de isotipo para a diluição mesmo que o anticorpo anti-PCM-1 para o controlo negativo, preparado no passo 2.1.
3. Incubar controlo negativo e tubo de amostra a 4 ° C durante a noite.
4. Lavar controlo negativo e amostra, pelo menos, uma vez com NSB mais tampão (tubos de girar para baixo numa centrifugadora refrigerada (4 ° C) a 700 xg durante 10 min. Elimine o sobrenadante e ressuspender o pellet núcleos em 1 ml de tampão mais NSB).
5. Adicionar anti-coelho de anticorpo fluorescente secundário (FITC ou APC) para controlo negativo e tubo de amostra em uma diluição de 1:1000.
6. Incubar controlo negativo e tubo de amostra a 4 ° C durante 1 h.
7. Lavar controlo negativo e amostra, pelo menos, uma vez com NSB mais tampão (tubos de girar para baixo numa centrifugadora refrigerada (4 ° C) a 700 xg durante 10 min. Descartar o sobrenadante e dissolver os núcleos sedimento em 1 ml de tampão mais NSB).
8. Continuar com a análise por citometria de fluxo e triagem.

3. Citometria de Fluxo

1. Revestimento tubos núcleos de recolha (Falcon de 15 ml) com 1% de solução de BSA / PBS antes de começar a citometria de fluxo de triagem, tal como descrito no passo 1,1.
2. Filtrar a amostra eo controlo negativo através de um filtro 30 uM célula e carregar primeiro o controlo negativo para o citómetro de fluxo (afluxo BD). Definir o portão primeiro e segundo para definir núcleos e singuletos (núcleos único), com base na dispersão para a frente (FSC), largura de pulso para a frente de dispersão (FS largura de pulso) e dispersão lateral (SSC) (Fig. 2a e b). Adicionando um DNA mancha (DRAQ5 (1:500)) para a amostra pode ajudar a identificar a população núcleos inicialmente.
3. Carregar a amostra immunolabeled e definir a terceira porta para isolar os núcleos dos cardiomiócitos (PCM-1-positve) de não-cardiomiócitos núcleos (PCM-1-negativo). Inicie a triagem(Fig. 2c, d).

Opcional: A fim de analisar o conteúdo de DNA nuclear (ploidia) e para executar a análise do ciclo celular adicionar uma mancha de DNA adequado para os núcleos (por exemplo, Hoechst 33342 ou DRAQ5) (fig. 2e).

4. Após a triagem de citometria de fluxo, colocar os núcleos em gelo e re-analisar para determinar a pureza de classificação (Fig. 3a e b).
5. Girar para baixo os núcleos classificados nos tubos de recolha a 1500 xg numa centrifugadora refrigerada durante 15 min.
6. Dissolve-se o pellet núcleos num tampão compatível com a aplicação a jusante.

4. Os resultados representativos

Morfologia núcleos e integridade pode ser avaliada por manchas de DNA e visualizada por microscopia (Fig. 1). Bem sucedida PCM-1 rotulagem pode ser avaliado por microscopia de epifluorescência e por citometria de fluxo (Fig. 1 e Fig.. 2c e d). PCM-1-positive e populações negativas devem ser bem separadas umas das outras (Fig. 2c, d). Em ventrículo esquerdo murino cerca de 30% de todos os núcleos deve ser os núcleos dos cardiomiócitos (Fig. 2d). Triagem pureza pode ser avaliada por re-analisando os núcleos ordenadas (Fig. 3a e b). Ambas as populações núcleos deve ter uma pureza superior a 95% de triagem.

Figura 1. PCM-1 identifica os núcleos dos cardiomiócitos. Núcleos Cardíaca (a) são coradas com anticorpos para PCM-1 (b), e para Nkx2.5 (c) em um coração de rato adulto. (D) PCM-1-rotulado núcleos são cercados por citoplasma dos cardiomiócitos (miosina de cadeia pesada (MHC)) e expressar o fator de transcrição Nkx2.5, documentando a identificação precisa de núcleos de cardiomiócitos pelo PCM-1 coloração (barras de escala 20 microns e 10 iM (d, inserção)). (E) isolados núcleos cardíacas visualizado com o DNA mancha DRAQ5. (Feg) Cardiomyocnúcleos YTE são rotulados com anticorpos contra PCM-1 (barra de escala 10 mm). Note, o padrão de coloração epinuclear de PCM-1 em núcleos dos miócitos em secção de tecido e em núcleos isolados (setas).

Figura 2. Classificação por citometria de fluxo de núcleos de cardiomiócitos. (A) núcleos cardíaca são identificados por dispersão frontal (FSC) e dispersor lateral (SSC). (B) Um segundo portão identifica núcleos único pelo FSC e largura de pulso FS ^5. (C, d) gating fluorescente permite a separação de núcleos de cardiomiócitos (PCM-1-positivo) e não-cardiomiócitos (PCM-1-negativa) núcleos a partir de tecido do coração. (E) cardiomiócito do rato são na maior parte (> 80%) diplóide (2n), apenas um pequeno subconjunto é tetraplóide (4n) ^6. Note, cardiomiócitos humanos contêm uma maior frequência de núcleos poliploidia (> 2n) ^7,8.

Figura 3. Análise de pureza de classificados núcleos dos cardiomiócitos e não-cardiomiócitos. Re-análise de núcleos não-ordenados dos cardiomiócitos (a) e cardiomiócitos (b). Ambas as populações apresentam um grau de pureza superior a 99% de classificação.

Discussão

A identificação precisa de núcleos de cardiomiócitos é crucial para a análise dos processos regenerativos no miocárdio ^2,3. As técnicas convencionais para isolar cardiomiócitos de tecido fresco baseiam-se principalmente a digestão enzimática de proteínas da matriz extracelular e da subsequente purificação a partir de células intersticiais por centrifugação a baixa velocidade. A purificação adicional de cardiomiócitos de vida a partir de células estaminais embrionárias (ESC) pode ser real...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Tampão de Lise
Nome do reagente
0,32 M de sacarose
10 mM Tris-HCl (pH = 8)
5 mM de CaCl2
5 mM de acetato de magnésio
2,0 mM de EDTA
0,5 mM de EGTA
1 mM de DTT

2. Tampão de sacarose

Nome do reagente

2,1 M de sacarose

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM de acetato de magnésio

1 mM de DTT

3. Tampão de núcleos de armazenamento (NSB plus)

Nome do reagente

0,44 M de sacarose

10 mM Tris-HCl (pH = 7,2)

70 mM de KCl

10 mM MgCl2

1,5 mM de espermina

Reagentes e Equipamentos	Companhia
Isotipo IgG de coelho-CHIP Grau, # ab37415	Abcam
De coelho anti-PCM-1 anticorpo, # HPA023374	Anticorpos Atlas
Burro seg. anticorpo, anti-coelho Alexa 488 Fluor, # A-21.206 ou sec equivalente. anticorpo fluorescente	Life Technologies
DRAQ5	Biostatus
Os filtros de células de 30 uM, 70 uM e 100 uM	BD Biosciences
Vidro douncer (40 ml) epilão "L"	VWR (Wheaton Industries, Inc.)
T-25 homogeneizador Ultra-Turrax	IKA Alemanha
Dispersão ferramenta S25 N-18 G	IKA Alemanha
Centrífuga Beckman Avanti	Beckman Coulter
Tubos Falcon de 15 ml e 50 ml	VWR
Tubos de centrífuga Beckman # 363664	Beckman Coulter
JS13.1 rotor livre balançando	Beckman Coulter
Citómetro Influx	Beckman Coulter
Rotator tubo	VWR