High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador

Resumo

Os métodos para o desenvolvimento e validação de um ensaio quantitativo de fluorescência para medir a actividade de potássio rectificador de entrada (Kir) canais de rastreio de alto rendimento composto é apresentado.

Resumo

Membros específicos da família retificador de potássio para o interior do canal (Kir) são postuladas alvos terapêuticos para uma variedade de doenças, incluindo a hipertensão, a fibrilação atrial, e de ^1,2 a dor. Para a maior parte, no entanto, os avanços na compreensão do seu potencial terapêutico, ou mesmo funções fisiológicas básicas foi retardado pela falta de boas ferramentas farmacológicas. Na verdade, a farmacologia molecular da família rectificador de entrada tem ficado muito aquém do da superfamília S4 de potássio dependentes da voltagem (Kv) canais, para o qual um número de afinidade nanomolar e moduladores de toxinas peptídicas altamente selectivos foram descobertos ^3. A toxina de veneno de abelha tertiapin e seus derivados são inibidores potentes da Kir1.1 Kir3 e canais de ^4,5, mas os péptidos são de uso limitado terapeuticamente bem como experimentalmente devido às suas propriedades antigénicas e de biodisponibilidade pobre, a estabilidade metabólica e a penetrância do tecido. O desenvolvimento de potentese selectivos de pequenas moléculas sondas com propriedades farmacológicas melhoradas será a chave para a plena compreensão da fisiologia e potencial terapêutico de canais Kir.

O Molecular Libraries Sondas de Produção Centro de Rede (MLPCN), apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Fundo Comum criou oportunidades para os cientistas acadêmicos para iniciar campanhas de sonda de detecção de alvos moleculares e vias de sinalização que necessitam de melhor farmacologia ^6. O MLPCN fornece aos pesquisadores acesso aos centros de indústria em escala de triagem e química medicinal e informática de apoio para desenvolver moléculas pequenas sondas para elucidar a função dos genes e redes de genes. O passo crítico para a admissão ao MLPCN é o desenvolvimento de um ensaio de meta-ou via específica robusto que é tratável através de rastreio de alto rendimento (HTS).

Aqui, descrevemos como desenvolver uma fluorescência baseada em tálio (Tl ⁺⁾ fluxo assay de Kir função do canal de rastreio de alto rendimento composto ^7,8,9,10. O ensaio é baseado sobre a permeabilidade do canal de K ⁺ de poro para o composto aparentado ⁺ K ⁺ Tl. A comercialmente disponível fluorescente Tl ⁺ corante repórter é utilizado para detectar o fluxo transmembranar de Tl ⁺ através do poro. Existem pelo menos três corantes disponíveis comercialmente que são adequados para os ensaios de fluxo de Tl ^+: BTC, FluoZin-2, e FluxOR ^7,8. Este protocolo descreve o desenvolvimento do ensaio usando FluoZin-2. Embora originalmente desenvolvidos e comercializados como um indicador de zinco, FluoZin-2 apresenta um aumento robusto e dose-dependente, na emissão de fluorescência após a ligação Tl ^+. Começamos a trabalhar com FluoZin-2 antes FluxOR estava disponível ^7,8 e continuaram a fazê-lo ^9,10. No entanto, os passos no desenvolvimento do ensaio são essencialmente idênticas para todas as três corantes, e os utilizadores devem determinar quais corante é mais apropriada para o seu n específicoeeds. Discutimos, também, referência do ensaio de desempenho que devem ser alcançados a ser considerado para a entrada no MLPCN. Desde Tl ⁺ facilmente permeia a maioria dos canais de K ^+, o ensaio deve ser adaptável para a maioria dos objectivos de K ⁺ channel.

Protocolo

1. A geração de linhas celulares estáveis ​​policlonais

1. O estabelecimento de uma linha de células de alta qualidade estável expressando o canal Kir de interesse é um primeiro passo importante para o desenvolvimento de um ensaio de rastreio de alto rendimento robusto. Constitutivo K ⁺ superexpressão do canal pode conduzir a activação de vias de morte celular, degeneração linha estável de células e perda de desempenho do ensaio. Para evitar estes problemas potenciais e proporcionar um controlo conveniente para o desenvolvimento interno do ensaio (ver abaixo), um sistema de expressão induzível por tetraciclina é recomendado ^8.
2. Cultura parental a T-REx-células HEK293 utilizando técnicas padrão em B-meio (DMEM meio de crescimento contendo 10% de FBS, 50 U / ml de penicilina, estreptomicina 50 ug / ml e 5 ng / ml blasticidina S). Utilização de células de passagem precoce (por exemplo, passagens de 3-4 desde descongelamento do armazenamento de azoto líquido) para a transfecção e selecção de clones estáveis.
3. Placa 4 milhões t-rex-HEK293 células em uma75 centímetros frasco ² de modo a que o frasco é de aproximadamente 80% confluentes no dia seguinte. Cultura durante a noite em 5% de uma incubadora de CO ₂ a 37 ° C.
4. Transfectar as células usando 10-15 ug de ADN e Lipofectamina pcDNA5/TO-Kir reagente LTX / Plus de acordo com o protocolo do fabricante. Após 5 horas, substituir o meio de transfecção com meio B-.
5. 24 horas após a transfecção, substituir o meio B-B-com meio contendo 250 ug / ml de higromicina (BH-meio) para iniciar a seleção de clones estáveis. Alimentar as células a cada 2-3 dias, com nova BH-médio.
6. Maior do que 90% das células devem morrer durante os 7 dias seguintes, deixando pequenas colónias de células transfectadas de forma estável. Permitir que as colónias a crescer durante um período adicional de 10-14 dias antes da divisão para um balão de 175 cm ² para a expansão.
7. Por criopreservação, congelar 3 x 10 ⁶ células / ml em meio contendo 45% de meio condicionado BH-, 45% livre de antibióticos, soro contendo DMEM e 10% de DMSO. Congelaras células durante a noite a -80 ° C em um recipiente de congelação de células e em seguida mover-se para azoto líquido para armazenamento a longo prazo. Descongelar as células de azoto líquido utilizando o protocolo recomendado da Invitrogen. Note-se que a viabilidade das células serão mais baixas se forem congelados a partir de um balão que é maior do que 75% confluentes no momento do processamento.

2. A geração de linhas celulares estáveis ​​monoclonais

1. Lavar uma sub-confluente 75 centímetros ² frasco de células estáveis ​​policlonais com divalente livres de HBSS. Adicionar 1 ml de tripsina e incubar durante 3-5 min em 5% de uma incubadora de CO ₂ a 37 ° C. Adicionar 5 ml de BH médio para o balão para inibir a actividade da tripsina e tritura-se repetidamente (por exemplo, 5 vezes) para dissociar completamente as células. Inspecione cuidadosamente as células em um microscópio para assegurar a suspensão é composto quase inteiramente de células individuais. Isto irá aumentar a probabilidade de obtenção de linhas de células monoclonais.
2. Determinar a densidade de células e diluira suspensão a uma concentração de 0,7 células por 20 pi. Utilizando um pipetador de canais múltiplos, pipeta 20 ul de suspensão de células em cada poço de BD PureCoat amina revestido (ou equivalentes de poli-D-lisina revestido) 384 poços. Em princípio, 70% dos poços devem receber uma célula com estas condições de revestimento. Assim, uma placa de 384 poços deverão conter mais de 200 clones para análise. Continuar a cultura das células em 5% de uma incubadora de CO ₂ a 37 ° C.
3. Depois de uma semana, inspeccionar as placas sob um microscópio para poços que continham colónias singulares. Observe a sua posição sobre a tampa com um marcador permanente para referência futura. Certifique-se também observar e excluir poços contendo colônias múltiplos. Estes são mais facilmente reconhecidos pelo aparecimento de colónias que crescem a partir de vários lados do poço. Estar cientes de que a evaporação tende a ocorrer mais rapidamente a partir de poços na proximidade da borda da placa. Adicionar BH-meio aos poços, onde a evaporação significativa ocorreu. Caso contrário, é desnecessário tó alimentar as células.
4. Monitorar os poços mais frequentemente durante os próximos dias 7-10. As células estará pronto para dividir quando os poços de interesse são pelo menos 50% confluentes.
5. Dividir as células para duplicar as placas 384 poços, uma placa de ensaio com Tl ⁺ fluxo e o outro para a continuidade das linhas monoclonais em cultura. Aspirar o meio dos poços que contêm as linhas celulares de interesse. Lavar as células com HBSS sem divalente, adicionar 20 ul de tripsina a cada poço e a placa de transferência para uma incubadora a 37 ° C durante 15-20 min. Depois de mover a placa de volta para a cobertura da cultura de células, adicionar 20 ul de BH médio a cada poço e tritura-se várias vezes para dissociar as células. Inspeccionar os poços sob um microscópio para garantir que as células são completamente dissociados. Isto pode requerer vários ciclos de pipetagem, como as células estará firmemente aderente. Uma vez que as células são dissociadas, transferir 10 ul de cada suspensão de células para poços duplicados de uma 38 nova BD PureCoat amina revestido4-bem chapa. Certifique-se de observar a relação entre a fonte de bem e duplicar poços de destino para que os clones apresentem atividade canal robusto Kir (veja abaixo) pode ser rastreada para o bem original. Adicionar 20 ul de BH médio para a fonte original bem para alimentar as células restantes e continuar em cultura em 5% de CO ₂ incubadora a 37 ° C.
6. Permitir que as células na placa de destino para aderir e crescer até uma semana. Uma vez que a maioria dos clones atingem confluência de pelo menos 50%, que pode ser avaliado para a actividade de canal Kir usando o ensaio de fluxo de Tl ⁺ descrita abaixo.
7. Um dia antes do ensaio, aspirar o meio de cultura e substitui-lo com BH meio contendo 10% de FBS dialisado. Isto evita a expressão do canal inadvertida que pode surgir a partir de soro contaminado tetraciclina. Kir induzir expressão de canal em apenas uma das cavidades em duplicado para cada clone através da inclusão de 1 ug / ml de tetraciclina. A duplicação não induzido vai servir bem como um"Background" de controle. Execute o Tl ⁺ ensaios de fluxo como descrito a seguir.

3. Geral Tl ⁺ Flux Procedimento de Ensaio

1. Um dia antes de uma experiência de fluxo Tl ^+, dissociar as células e quantificar a densidade da suspensão de células, tal como descrito nas secções 2.1 e 2.2. Placa de 20.000 células monoclonais transfectadas estavelmente com um gene de canal de Kir interesse em cada poço de uma amina PureCoat BD-revestido placa de 384 poços utilizando uma combi Thermo Multidrop ou um pipetador multicanal. Use BH meio contendo 10% de FBS dialisado para o plaqueamento. Note-se que algumas células são cultivadas durante a noite com 1 ug / ml de tetraciclina para induzir a expressão do canal Kir, enquanto que outros não. A localização de células induzidas e não induzidas são diferentes para cada tipo de experiência e são mostrados na Figura 1.
2. No dia seguinte, inspeccionar as placas sob um microscópio para garantir que as células são aderentes e é distribuído uniformemente através do fundodos poços. Os poços devem ser de 80-90% confluentes.
3. Use uma lavadora de microplacas ELx405 para substituir o meio de cultura celular com 20 ul por poço de tampão de ensaio de HBSS contendo 20 mM de HEPES e tamponado a pH 7,3 com NaOH. Alternativamente, pode-se utilizar um "estalido e bater" método, em que a placa é invertido e agarrou-se abruptamente para ejectar o suporte em um recipiente de desperdícios, e em seguida bateu sobre toalhas de papel empilhadas para remover o material remanescente. Imediatamente adicionar novamente tampão de ensaio HBSS para a placa para evitar que as células de dessecação.
4. Prepare o FluoZin-2, AM solução corante. Após uma breve centrifugação do tubo, dissolver 50 mg de FluoZin-2 em pó em 100 ul de DMSO anidro. Neste ponto, alíquotas da solução de estoque de 1000 x pode ser armazenada a -20 ° C para uso posterior. Quando pronto para uso, adicionar 50 ul de uma massa de 20% por volume de solução de Pluronic F-127/DMSO para o corante e misture com pipetagem suave. Não congelar uma vez que o corante de Pluronic F-127 foi adicionado, comobaixa temperatura pode fazer com que o agente tensioactivo a fim de precipitar a partir da solução. Adicionar o volume de 150 ul de FluoZin-2, AM/Pluronic-F127 a 100 ml de tampão de ensaio e misturar suavemente HBSS para fazer o tampão de carga de corante. Usando um Combi Multidrop ou pipetador multicanal, adicionar 20 ul de tampão de carga de corante para cada poço já contendo 20 ul de tampão de ensaio de HBSS. Incubar as células à temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora (tipicamente a incubação foi realizada no escuro, embora não haja evidência directa de que é necessário).
5. Enquanto as células são de carga com corante, preparar uma placa de estímulo Tl ^+. Recém dissolver 0,5 g de bicarbonato de sódio em 50 ml de tampão 5x estímulo Tl ⁺ contendo 1 mM de sulfato de magnésio, sulfato de cálcio 1,8 mM, glucose a 5 mM, HEPES 10 mM e 12 mM ⁺ sulfato de Tl. Alternativamente, o bicarbonato de sódio pode ser substituído por gluconato de sódio, se, por exemplo, o pH da solução deve ser mantida dentro de uma faixa muito estreita e a perda de dióxido de carbonoé uma preocupação. Tapar o tubo firmemente para limitar o escape de dióxido de carbono e inverta várias vezes até que o bicarbonato de sódio entra em solução. Utilizando um pipetador de canais múltiplos, adicionar 50 ul da solução em cada poço de um polipropileno de 384 poços da placa (Tabela 1).
6. Depois que as células foram carregadas com FluoZin-2, AM, lavar as placas com uma lavadora de microplacas ELx405 ou usando o "flick e bater" método, tal como descrito acima na secção 3.3. Dependendo do tipo de fluxo de Tl ⁺ experimento a ser realizado, adicionar novamente 20 ul ou 40 ul de tampão de ensaio de HBSS a cada poço. As placas estão prontas para experiências.
7. A célula e Tl ⁺ placas em um sistema de Triagem de Hamamatsu Funcional Drogas (FDSS) ou leitor de placa equivalente cinética de imagem com líquido integrado capacidades de distribuição. Usar filtros apropriados para a fluoresceina / fluoresceína à base de corantes, tais como Fluo-4.
8. Definir um protocolo único suplemento para que o Tl 10 jul 5x ⁺série é adicionada aos poços correspondentes da placa de células contendo 40 ul de tampão de ensaio de HBSS. Fluorescência registo inicial, ao fim de uma frequência de amostragem de 1 Hz durante pelo menos 10 segundos. A fluorescência poço-a-poço deve ser uniforme e estável ao longo da placa, uma vez as condições de carga de revestimento óptima de células de lavagem, e corante são estabelecidos. Um sistema integrado 384-pipetador de canais é usada para adicionar simultaneamente o estímulo ⁺ Tl tampão a cada poço.
9. Registo para, pelo menos, 2 minutos, de modo que a taxa e o pico de Tl ⁺ induzido por um aumento na fluorescência é capturado para análise off-line.

4. Determinação da concentração ideal + Tl

1. Tl ⁺ prontamente permeia mais para dentro do retificador canais de K ^+. Para assegurar que as concentrações de Tl ⁺ não excedem a faixa dinâmica do Tl ⁺ corante repórter FluoZin-2, deve-se determinar empiricamente a concentração óptima Tl ⁺ para ser usado em um alto-throughput tela. Recomenda-se uma concentração de Tl ⁺ que evoca a 80% da resposta máxima de fluorescência (CE ₈₀₎ sob condições em que o canal é maximamente activados.
2. Carga da placa, corante e lavar as células em BD PureCoat amina revestidos ou equivalente de poli-D-lisina-revestidas com placas de 384 poços, tal como descrito acima na secção 3, deixando 40 ul de tampão de ensaio de HBSS em cada poço. Como mostrado no mapa da placa na Figura 1A, a coluna 1 e as linhas A1-A23 deve conter células que não foram induzidas com tetraciclina e portanto não expressam o canal Kir de interesse. Os sinais de fluorescência FluoZin-2 a partir dos poços não induzidas serão utilizados para determinar o nível de fluxo de Tl ⁺ através de vias endógenos, tais como o Na ⁺ - K ^+-ATPase e K ⁺ voltagem gated canais, que são normalmente expressas em células HEK- 293 células.
3. Use um Agilent Bravo Automated Platform Manuseamento de líquidos ou de pipetagem manual para preparar um11-point Tl ⁺ séries de diluição de concentração em HBSS tampão de ensaio. Tipicamente, uma série de 3 vezes de diluição em série variando de 100% a 0,002% de Tl ^{+ foi} avaliada no ensaio. A série deve ser feita a uma concentração 5x porque as soluções Tl ⁺ será diluída 1:5 no ensaio final. Preparar diluições em série por diluição do padrão de 5x tampão de Tl ⁺ descrito na secção 3, com uma Tl 5x ⁺ livre de tampão contendo 1 mM de sulfato de magnésio, sulfato de cálcio 1,8 mM, 5 mM de glicose e 10 mM de HEPES. Novamente, recém dissolver 0,5 g de bicarbonato de sódio em 50 ml de tampão final ⁺ Tl imediatamente antes do plaqueamento em polipropileno de 384 poços da placa de acordo com o mapa da placa mostrada na Figura 2A.
4. Carregar a célula e as placas de estímulo Tl ⁺ no FDSS. Estabelecer um protocolo de um único suplemento de modo que 10 ul a 5x Tl ⁺ série é adicionada aos poços correspondentes da placa de células contendo 40 ul de HBSS tampão de ensaio. Registo de linha de base de fluorescência FluoZin-2 durante 10 segundos antes da adição de Tl ⁺ para a placa. Repita a experiência em 3 dias diferentes para estabelecer a reprodutibilidade dos resultados.

5. Determinação da sensibilidade do ensaio de DMSO

1. As moléculas pequenas interrogados em uma tela de alto rendimento são dissolvidos em sulfóxido de solvente orgânico de dimetilo (DMSO), que por si só podem afectar o desempenho do ensaio. Por conseguinte, a sensibilidade do ensaio de DMSO deve primeiro ser examinada para determinar a concentração máxima admissível de DMSO no ecrã.
2. Carga da placa, corante e lavar as células em BD PureCoat amina revestido placas 384-poços, tal como descrito acima na secção 3, deixando 20 ul de tampão de ensaio de HBSS em cada poço. A totalidade da placa deve conter células que foram induzidos com tetraciclina (Figura 3A).
3. Use um Bravo Plataforma tratamento automatizado líquido ou pipetagem manual para preparar uma D 11 pontosMSO série de diluição em tampão de ensaio de concentração de HBSS. Tipicamente, uma série de diluições de 2 vezes variando de 10% a 0,01% v / v de DMSO é avaliada para a actividade no ensaio. A série deve ser feita com uma concentração de 2x, porque as soluções de DMSO serão diluídas para metade no ensaio final. A série de diluição deve ser plaqueadas em placas de polipropileno de 384 poços da placa, de acordo com o mapa da placa mostrada na Figura 3A.
4. Prepare um prato de estímulo 5x Tl ⁺ baseada na CE ₈₀ ou Tl ótimo ⁺ concentração determinada na seção 4.
5. Carregar a célula, DMSO e Tl ⁺ placas de estímulo para o FDSS. Estabelecer um protocolo de dois suplemento de modo que 20 ul de 2x a concentração de DMSO série é adicionada aos poços correspondentes da placa de células contendo 20 ul de tampão de ensaio de HBSS. Deixar o DMSO em células para a mesma quantidade de tempo que as células serão expostas a pequena molécula veículo durante uma tela. Registro inicial FluoZin-2 de fluorescência para apelo menos 10 segundos antes da adição de 10 ul de tampão 5x Tl ⁺ a cada poço da placa de células. Repita a experiência em 3 dias diferentes para estabelecer a reprodutibilidade dos resultados.
6. O ensaio deve ser tolerante para concentrações de DMSO, pelo menos, 0,1% v / v para uma tela de alto rendimento típico, no qual os compostos são testados a uma concentração de 10 uM.

6. Determinação da sensibilidade do ensaio para moduladores farmacológicos conhecidos

1. Depois de determinar a tolerância óptima Tl ⁺ e concentração de DMSO de ensaio, os efeitos dos conhecidos agentes farmacologicamente activos no canal Kir mediada Tl ⁺ fluxo deve ser examinado. Esta série de experiências irá avaliar o ensaio de sensibilidade, a capacidade de patente de ordem compostos com base na sua potência, a capacidade de classificar os compostos com base no seu modo de eficácia (por exemplo, activador, inibidor), e identificar os compostos de controlo bem comportados para ser usado mais tarde na o ensaio desenvolvimento e tela.
2. Carga da placa, corante e lavar as células em BD PureCoat amina revestido placas 384-poços, tal como descrito acima na secção 3, deixando 20 ul de tampão de ensaio de HBSS em cada poço. A coluna 1 e as linhas A1-A23 deve conter células que não foram induzidas com tetraciclina (Figura 4A).
3. Use um Bravo Plataforma tratamento automatizado líquido ou pipetagem manual para preparar uma série de 11 pontos de diluição concentração de moduladores conhecidos no tampão de ensaio HBSS. Tipicamente, uma série de diluições de 3 vezes variando de 100 pM a 2 nM para a actividade é avaliada no ensaio. A série deve ser feita com uma concentração de 2x, porque as soluções de DMSO serão diluídas para metade no ensaio final. A série de diluição deve ser plaqueada em triplicado, com um polipropileno de 384 poços da placa, de acordo com o mapa da placa mostrada na figura 4A. Certifique-se de que as diluições são feitas de tal modo que as concentrações finais de DMSO são iguais entre os tratamentos com medicamentos e menos tha n ou igual à concentração máxima permitida DMSO definidos na secção 5.
4. Prepare um prato de estímulo 5x Tl ⁺ baseado no ideal de concentração ⁺ Tl determinado no ponto 4.
5. Carregar a célula, o composto e as placas de estímulo Tl ⁺ no FDSS. Estabelecer um protocolo de dois suplemento de modo que 20 ul do composto em série 2x concentração são adicionados aos poços correspondentes da placa de células contendo 20 ul de tampão de ensaio de HBSS. Adicionar os compostos à placa de células e incubar durante até 20 min. Note-se que o tempo de incubação óptimo para os compostos para detectar a melhor relação sinal-fundo pode ser determinada através da execução de uma série de experiências em que dois diferentes tempos de incubação são escolhidos. Registo de linha de base de fluorescência FluoZin-2 durante pelo menos 10 segundos antes da adição de 10 ul de tampão 5x Tl ⁺ a cada poço da placa de células. Repita a experiência em 3 dias diferentes para estabelecer a reprodutibilidade dos resultados.

_title "Análise> 7. Checkerboard

1. Na série seguinte de experiências, a uniformidade e reprodutibilidade do ensaio será avaliada utilizando um "tabuleiro de xadrez" análise. Tipicamente, um inibidor de controlo é plaqueada em cada poço outro de cada coluna e linha de uma placa de 384 poços, como mostrado na Figura 5A. Para avaliar rigorosamente o ruído no ensaio, uma EC ₈₀ de concentração de inibidor deve ser usado. DMSO é adicionado às cavidades outros como um controlo do veículo. Tl ⁺ fluxo em DMSO-droga e células tratadas é usado para calcular um valor para Z privilegiada, uma medida estatística de poço-a-poço variabilidade entre as duas populações de poços. Z principal é calculada utilizando a fórmula:
   Z nobre = 1 - _(p + 3SD 3SD _n) / | _p + significa dizer _n |
   onde SD é o desvio padrão, p é o fluxo desinibido e n é totalmente inibida valores de fluxo. Um ensaio com valores maiores ou iguais a 0,5 Z ', em 3 dias diferentes é considerado suitable para high-throughput screening.
2. Carga da placa, corante e lavar as células em BD PureCoat amina revestido placas 384-poços, tal como descrito acima na secção 3, deixando 20 ul de tampão de ensaio de HBSS em cada poço. Note-se que a totalidade da placa deve ser induzida com tetraciclina.
3. Fazer uma placa de composto / DMSO pipetando para uma placa de polipropileno de 384 cavidades utilizando uma pipeta multi-canal, 80 ul / cavidade de um inibidor conhecido do canal do Kir-alvo, na concentração determinada no ponto 6.5, e 0,1% v / v de DMSO veículo, como mostrado na Figura 5A. Adicionar o inibidor de partida conhecido no poço A1 utilizando o pipetador multicanal e alternativo para bem B2 e assim por diante até bem B24. Repita este procedimento com DMSO a partir de B1 bem e assim por diante até bem A24. O layout final da placa deve coincidir com a de um tabuleiro de xadrez.
4. Prepare um prato de estímulo 5x Tl ⁺ baseado no Tl ótimo ⁺ determinado no ponto 4.
5. Carregar a célula, composto e Tl ⁺ estímulo placas no FDSS. Estabelecer um protocolo de dois suplemento de modo que 20 ul do composto em série 2x concentração são adicionados aos poços correspondentes da placa de células contendo 20 ul de tampão de ensaio de HBSS. Adicionar os compostos à placa de células e incubar durante 20 min até à temperatura ambiente. Registo de linha de base de fluorescência FluoZin-2 durante pelo menos 10 segundos antes da adição de 10 ul de tampão 5x Tl ⁺ a cada poço da placa de células. Repita a experiência em 3 dias diferentes para estabelecer a reprodutibilidade dos resultados.

8. Tela piloto

1. Na fase final de desenvolvimento do ensaio, efectuar uma tela de piloto de alguns milhares de compostos para avaliar o desempenho do ensaio, sob condições que irão ser utilizados, eventualmente, em grande escala de tela de alto rendimento.
2. Carga da placa, corante e lavar as células em BD PureCoat amina placas revestidas com 384-poços, tal como descrito acima no ponto 3), deixando 20 ul de tampão de ensaio de HBSS em cada poço.Note-se que a totalidade da placa deve ser cultivadas durante a noite com tetraciclina para induzir a expressão Kir canal.
3. Seleccione cerca de 2.000 a 3.000 compostos estruturalmente diversos para serem testadas. Muitas vezes, é apropriado e conveniente usar conjuntos de compostos com actividades conhecidas potencialmente enriquecidas em moduladores dos canais de iões. Coleções incluem a coleção de Espectro (MicroSource) ea coleção LOPAC (Sigma). Além disso, é prudente incluem moduladores conhecidos do Kir de interesse no ecrã piloto. Idealmente, estes compostos serão adicionados a poços de uma forma cega, a fim de permitir um teste objectivo dos métodos de colheita batida descritas posteriormente. Preparar os compostos em placas de 384 poços de polipropileno (placas de destino) utilizando um manipulador de líquidos ou uma ferramenta de eco Labcyte pino adequado para transferir um volume adequado de compostos seleccionados em DMSO a partir da recolha de MLPCN (placas de fonte) para as placas de destino Note-se que os compostos de teste são apenas nas colunas 3-22;Em todos os outros bem de colunas 1, 2, 23, 24 adicionar um inibidor conhecido a uma concentração conhecida plenamente inibir a Quir, conforme determinado no item 7. Nos restantes poços de colunas 1, 2, 23, 24 e adicionar o volume apropriado de DMSO para produzir controlos DMSO concentração de correspondência de veículos. Diluir todos os poços com tampão de ensaio utilizando o Combi Multidrop. Tipicamente os compostos de ensaio são de 20 uM, duas vezes acima da sua concentração de rastreio alvo.
4. Faça placas TL ⁺ de estímulo com base no ideal Tl concentração ⁺ determinado no ponto 4.
5. Executar a tela do piloto. Tome cuidado para escalonar as etapas de execução do protocolo de manter tempo consistente entre as placas, a longo triagem piloto.
6. Quando a tela do piloto está concluído, analisar os poços de xadrez, das colunas 1, 2, 23 e 24, usando a equação Z-prime. Inspeccionar as placas que mostram Z-prime os valores de menos de 0,5 para determinar a fonte de uma separação deficiente de populações de controlo. Acessos pode be seleccionada usando uma série de métodos. Para telas piloto é comum para o cálculo da média e desvio padrão da população de controlo do veículo e escolher hits com base em poços produtores valores> / = 3 desvios padrão em relação à média dos controlos do veículo.
7. Após a colheita de sucesso, reteste sucessos selecionados em duplicado em dois conjuntos de placas. Um conjunto de placas inclui a célula Kir estável na ausência de tetraciclina e o outro contém a linha celular estável Kir, na presença de tetraciclina. Hits que reteste positivo em pelo menos uma das duas placas de reteste e não mostram uma actividade significativa nas placas não induzidas podem ser considerados verificou hits. Examine a lista de ocorrências verificadas para determinar quantos dos "escondidos" amostras de controlo foram detectados. Não é possível detectar os controles na tela piloto indica a necessidade de uma maior otimização dos parâmetros de triagem ou bater-picking.

Resultados

A utilização de um sistema de expressão induzível por tetraciclina fornece um controle interno conveniente para distinguir Tl ⁺ fluxo através de vias endógenos e do canal Kir de interesse. Figura 1 mostra alguns exemplos de mapas de células de revestimento utilizados em diferentes tipos de ensaios. As posições dos poços que contêm as células não induzidas ou induzida por tetraciclina são indicados com cores diferentes. Figura 2A mostra o mapa da placa de base ut...

Discussão

Tratamento de dados: Uma vez que os dados são recolhidos, um passo comum na análise envolve a normalizar resposta da fluorescência de cada poço, F, ao seu valor inicial no início da experiência, F _0. Isto é vulgarmente referido como o "índice estático" e simbolizado "F / F ^_0". Nos casos em que F ₀ é dominado pelo corante indicador de operação estática proporção substancialmente corrigir por muitos factores tais como desunifor...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetraciclina-vector de expressão indutível
T-rex-células HEK293	Invitrogen	R71007	Tetraciclina induzível por linha celular
Lipofectamine Reagente LTX / Plus	Invitrogen	15338100	Reagente de transfecção
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Meios de cultura de células
DMEM	Invitrogen	11965	Meios de cultura de células
Higromicina B	Invitrogen	10687-010	Meios de cultura de células
Blasticidina S	Invitrogen	R210-01	Meios de cultura de células
Penicilina / estreptomicina	Invitrogen	15140	Meios de cultura de células
HBSS-bivalente livre	Mediatech	21022CV	Lavagem de células
Tripsina 0,25%	Mediatech	25053CI	Dissociação celular
Tetraciclina-HCl	Sigma	T9823	Reagente indução
FBS dialisado	ATLANTA Biologicals	S12650	Meios seletivos
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Corante fluorescente
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Corante de carga
HBSS	Invitrogen	14175	Tampão de ensaio
HEPES	Invitrogen	15630	Tampão de ensaio
NaHCO3	Sigma	S6297	Tl + estímulo tampão
MgSO4	Sigma	M2643	Tl + estímulo tampão
CaSO 4 • 2H 2 O	Sigma	C3771	Tl + estímulo tampão
D-Glucose	Sigma	G7528	Tl + estímulo tampão
Sulfato de tálio	Aldrich	204625	Tl + estímulo tampão
HEPES	Sigma	H4034	Tl + estímulo tampão
DMSO	Sigma	D4540	Solvente
Oito canais pipetador eletrônico	Biohit	E300	Chapeamento de celular em 384 -placas de poços
BD PureCoat amina revestidos 384 poços	BD Biosciences	356719	Microplacas de ensaio
Eco qualificados 384-Bem polipropileno microplaca (384PP)	Labcyte	P-05525	Fonte microplacas compostos
384-poços de microplacas de polipropileno	Greiner Bio-One	781280
Dispensador de reagente Multidrop Combi	Thermo Scientific	5840300
ELx405 lavadora	BioTek	ELx405HT	Lavagem de células automatizado
Echo manipulador líquido	Labcyte	Labcyte Eco 550
Bravo plataforma automatizado de manuseamento de líquidos	Agilent Technologies	Modelo padrão
Hamamatsu 6000 FDSS	Hamamatsu		Cinética de imagem placa leitor