Medição dos Efeitos de anticorpos sobre a função celular de cardiomiócitos isolados

Resumo

O método apresentado oferece um modo para detectar auto-anticorpos funcionais eficazes cardiotrópicos no plasma de pacientes com cardiomiopatia dilatada, independentemente do antigénio específico, por meio da análise do impacto da imunoglobulina paciente isolado no encurtamento celular e os transientes de cálcio intracelular em cardiomiócitos de ratos isolados.

Resumo

Cardiomiopatia dilatada (CMD) é uma das principais causas para a insuficiência cardíaca em adultos mais jovens ^1. Embora predisposição genética e exposição a substâncias tóxicas são causas conhecidas para essa doença em cerca de um terço dos pacientes, a origem de DCM permanece amplamente claro. Num número substancial de pacientes, os auto-anticorpos contra epítopos cardíacos foram detectados e são suspeitos de desempenhar um papel crucial na iniciação e progressão da doença de ^2,3. A importância dos anticorpos cardíacos é sublinhado por uma melhoria hemodinâmica observada em pacientes com CMD após a eliminação de auto-anticorpos por imunoadsorção ^3-5. Uma variedade de antigénios específicos já foram identificados ^2,3 e anticorpos contra estes objectivos podem ser detectados por imunoensaios. No entanto, estes ensaios não pode discriminar entre o estímulo (ou seja funcionalmente eficaz) e bloqueio de auto-anticorpos. Há cada vez mais evice que esta distinção é ^6,7 crucial. Pode também considerar-se que os objectivos estabelecidos para um certo número de anticorpos cardiotrópicos ainda não identificado e, portanto, não pode ser detectada por imunoensaios. Assim, foi estabelecido um método para a detecção de anticorpos funcionalmente activos cardiotrópicos, independentemente do seu antigénio correspondente. O pano de fundo para o método é a elevada homologia normalmente observada para as regiões funcionais de proteínas cardíacas em mamíferos entre ^8,9. Isto sugere que os anticorpos dirigidos contra antigénios cardíacos humanos reagem de forma cruzada com as células-alvo não-humanos, o que permite o teste de IgG de pacientes com CMD em cardiomiócitos de ratos adultos. O nosso método consiste em três passos: primeiro, a IgG é isolada a partir de plasma de paciente com Sepharose acoplada anti-IgG de anticorpos obtidas a partir de colunas de imunoadsorção (PlasmaSelect, Teterow, Alemanha). Em segundo lugar, os cardiomiócitos adultos são isolados através de perfusão com colagenase num aparelho de perfusão Langendorff usando aprotocolo modificado de trabalhos anteriores ^10,11. Os cardiomiócitos obtidos estão ligados a esfregaços laminina revestidos septadas e coradas com Fura-2, um corante fluorescente de cálcio selectivo que pode ser facilmente levado para dentro da célula para observar o cálcio intracelular ^{(Ca2 +)} conteúdo ^12. No último passo, o efeito de IgG do paciente sobre a redução das células e os transientes de Ca ^{2 +} de cardiomiócitos de campo estimulado é monitorizada utilizando uma linha de cálcio comercial miócito e contractilidade sistema de monitorização (IonOptix, Milton, MA, EUA), ligado a um padrão inverso fluorescente microscópio.

Protocolo

1. IgG isolamento de amostras de pacientes

1. Prepare mini-colunas de imunoadsorção preenchendo 3 ml anti-IgG Sepharose por paciente 2 ml de EDTA plasma em um vazio coluna Econo Pac. IgG isolamento requer, pelo menos, 2 ml de plasma do paciente.
2. Colocar um filtro na parte superior da sefarose anti-IgG, cortou a ponta inferior da coluna e prima do filtro para atingir uma taxa de fluxo de cerca de 1 gota / seg. Deixe a solução de preservação correr para fora da coluna.
3. Lavar a coluna com 3 volumes de NaCl a 0,9% por volume de plasma.
4. Pipetar a plasma na coluna. Quando o plasma foi completamente imerso na sefarose anti-IgG, lava-se com o mesmo volume de NaCl 0,9%.
5. Pipeta de volume de plasma de uma glicina 0,2 M de HCl, pH 2,8 na coluna e deixar o imergir em sefarose. Adicionar outra quantidade de glicina HCl na coluna. Recolher o fluxo através de um tubo de 15 ml e ajustar o pH para 7,3 com 0,5 M de Tris-HCl, pH 8,0.
6. Para regenerar a coluna, Lava-se com 3 volumes de plasma glicina HCl. Após uma lavagem final com dois volumes de NaCl a 0,9%, a coluna pode ser utilizada para a amostra de plasma a seguir. Alternativamente, a coluna pode ser preenchida com uma solução de preservação e armazenado a 4-8 ° C durante até 4 semanas.
7. Para utilização em cardiomiócitos, a fracção de IgG recolhido terá de ser dialisada contra tampão experimental (EB). Para a preparação de EB, adicionar 117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM _MgCl2, 1,2 mM de KH ₂ PO _4, 1,2 mM _CaCl2, 10 mM de HEPES e 20 mM de glucose a 1 L de água destilada num agitador magnético e ajustar o pH para 7,3.
8. Encher a fracção de IgG a um tubo de membrana de celulose de éster de diálise com um peso molecular de corte de 100 kDa. Colocar o tubo em 1 EB L e agitar lentamente com um agitador magnético, a 4 ° C. Depois de 8 horas, transferir o tubo de diálise em 3 L de EB fresco e dialisar para outro h 20 a 4 ° C.
9. Seguindo calor diálise, a amostra durante 30 min a 57 ° C num banho de água a inactivatfactores do complemento e. Determinar a concentração de IgG total e se preparar alíquotas contendo 330 ug de IgG de cada. Quando a adição da amostra para a medição de cardiomiócitos (passo 4.3), enchem-se as alíquotas de 1 ml com EB. Alíquotas não diluídas podem ser armazenadas a -20 ° C até à sua utilização.

2. Isolamento de cardiomiócitos de ratos

1. Para a preparação de Ca ^{2 +} sem tampão de isolamento (IB), adicionar 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM de _MgSO4, 1,2 mM de KH ₂ PO _4, 20 mM de HEPES e 11 mM de glucose a 1 L de água destilada, utilizando um campo magnético agitador. Ajustar o pH a 7,4 à temperatura ambiente e filtrar através de um filtro de 0,2 uM topo frasco para esterilização.
2. Encher 80 ml de IB no reservatório superior de um sistema de controlo termostático Langendorff perfusão. Ajuste as configurações do termostato para manter uma temperatura de tampão de 37 ° C e arejar tampão com _95% de O2 / 5% de CO ₂ durante 30 min.
3. Pesar cerca de 10.000 - 12.000 U de collagenase tipo II, 175 mg de ácido gordo livre de BSA e dissolver em 20 ml contendo IB 22,5 ul de uma solução 100 mM de CaCl stock _2. Controlar o pH do tampão de isolamento no reservatório superior e ajustar se necessário.
4. Anestesiar um rato Wistar de 175 - 200 g com 375 tiopental peso mg / kg de peso corporal. Adicionar 2500 UI de heparina à solução de tiopental. Após toracotomia do coração, a extirpar cuidadosamente com um arco aórtico intacta e transferi-lo para gelado de NaCl 0,9%. Limpar o coração a partir do sangue e do tecido circundante e da transferência de NaCl a 0,9% fresco. Expor a aorta, abra o redutor de fluxo do sistema de Langendorff para se obter uma velocidade de queda de 2-3/sec e anexar o coração à cânula.
5. Perfundir o coração por até 3 min, com uma taxa de fluxo de 1 gota / segundo para lavar o sangue restante. Começam a circular as IB no sistema Langendorff. Remover 20 mL de tampão a partir do reservatório superior, preencher a solução de colagenase e de recarga como tampão tanto quanto necessário para atingir 80 ml. Circular o c solução ollagenase por outro 27 min. Taxa de fluxo deve ser controlado periodicamente e mantido a 1 gota / seg usando o redutor de fluxo.
6. Retire o coração da cânula, limpa a partir de átrios e aorta e pique em pedaços pequenos. Permitir que a solução de colagenase a correr para o reservatório inferior, a reduzir o volume a um máximo de 40 ml e ainda mais digerir os ventrículos picados por 10 - 15 min sob arejamento contínuo com 95% O% _2/5 CO _2. Em seguida, filtrar a suspensão de células através de uma gaze de 200 ^ M de tamanho de malha para um tubo de 50 ml.
7. Restabelecer o teor de Ca ^{2 +} das células em 3 passos: centrifugar a suspensão de células a 43 xg durante 2 min à temperatura ambiente e Ressuspender as células em 10 ml IB contendo 200 ^ M _de CaCl2. Centrifugar novamente e ressuspender as células em 10 ml de IB com 500 ^ M CaCl _2. Após uma centrifugação final, ressuspender em cardiomiócitos EB filtrada estéril (ver 1.8) a uma densidade de 50.000 células / ml.

e_title "> 3. Fura-2 coloração dos cardiomiócitos

1. Brasão uma lamela 4 bem compartimentado com 10 mg por laminina bem e espere até que esteja completamente seco.
2. Encha 1 ml da suspensão de cardiomiócitos em cada poço utilizando uma micropipeta com uma ponta de corte. Permitir que as células a aderir durante 1 hora à temperatura ambiente.
3. Diluir 10 uL de 1 mg / ml de Fura-2:00 em solução de 5 ml de EB. Manter a solução de coloração no escuro.
4. Tire tampão e solta células da lamela e pipeta 0,5 ml da solução de coloração em cada poço. Incubar as células durante 10 min sob agitação moderada. Subsequentemente, retire a solução de coloração, lavar as células uma vez com 1 ml de EB e, finalmente, encher EB 0,5 ml em cada poço. Evite luz direta durante o processo de coloração e sempre manter as células manchadas no escuro.

4. Gravação do Encurtamento celular e Ca ^{2 +} Transients

1. Coloque a lamela câmaras numa m fluorescência inversaicroscope cálcio ligado a um sistema de gravação de miócitos e contractilidade. Posicionar um eléctrodo feitos com um influxo e efluxo de tubo na primeira cavidade. Cardiomiócitos Superfuse com 1 EB ml / min e iniciar a estimulação eléctrica (20 V, 1 Hz, 5 ms de duração). Permitir que as células se adaptar à estimulação por cerca de 2 min.
2. Escolha uma haste intacta forma de cardiomiócitos com estrias claras e contração constante. Posicionar a célula no centro do campo visual e abrir o canal da câmara. Orientar a célula horizontalmente dentro da área de vídeo através da rotação do adaptador enquadramento célula e mover a platina do microscópio.
3. Ajuste a detecção de borda elementos de controle da área de vídeo (figura 2), abrir o canal de fluorescência e registro 10-15 contrações para obter a redução de células inicial e Ca ^{2 +} transiente.
4. Fechar o canal de luz do microscópio a fim de evitar o branqueamento do corante fluorescente. Comutar o fluxo através da EB para a amostracontornar com uma válvula de 3-vias e cardiomiócitos superfuse com 1 ml de IgG paciente. Parar a bomba antes do ar atingir o bem.
5. Abrir o canal de luz e gravar outro 10-15 contrações para obter a resposta aguda de células. Pausar a gravação e fechar o canal de luz novamente. Repetir a gravação após 2 e 5 min.
6. Retire o eletrodo do poço. Limpe cuidadosamente os tubos com EB e continuar com o bem próxima da lamela câmaras.
7. Analisar o encurtamento celular e Ca ^{2 +} transiente com o software IonWizard usando o "Edge-Length/Length" e "2-fura numérico subtraído / Ratio" janela, respectivamente. Calcula-se a percentagem de alteração a partir do encurtamento celular inicial e Ca ^{2 +} transiente da altura do pico que se refere à linha de base (% de pico bl h) para a fase aguda, a 2 minutos e a resposta de 5 min.

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Resultados

Dois exemplos para a medição do inotropismo celular no campo estimulado cardiomiócitos adultos (Figura 2), utilizando um dos miócitos Ca ^{2 +} e do sistema de gravação de contratilidade são dadas abaixo. Figura 3 dá uma impressão de uma medida de controlo, enquanto que na Figura 4, o efeito dos anticorpos cardiodepressive de um paciente com DCM é mostrado.

Em ambos os exemplos, encurtamento celular inicial e Ca ^{2 +}

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Discussão

O método apresentado oferece um modo adequado, para detectar auto-anticorpos funcionalmente eficazes cardíacos em pacientes com DCM de origem incerta. Em comparação com os outros métodos, por exemplo, a detecção de anticorpos funcionais activos contra o β1-adrenérgico por seu impacto sobre os níveis de cAMP ^6, o nosso método é independente de um epitopo específico. Claro que há outros epítopos ensaios independentes descritos na literatura, ou seja, a taxa de contagem de cardio...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente / equipamento	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Immunosorba solução de preservação	Fresenius Medical Care	903609211
A colagenase do tipo 2	Sistema de célula	LS004176
BSA, ácidos graxos livres	Sigma-Aldrich	A6003
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020
Fura-02:00	Sigma-Aldrich	F0888	1 mg / ml em DMSO
Econo Pac colunas de cromatografia	BioRad	732-1010
Spectra / Por Biotech éster de celulose Diálise Membrane	Spectrumlabs	131417
4 bem Chambered lamela	Nunc	155383
O cálcio dos miócitos e Sistema de Gravação Contratilidade	IonOptix
IonWizard software de análise de 6,0	IonOptix