Um ensaio para a permeabilidade do neuroepitélio Zebrafish Embryonic

Resumo

Nós descrevemos uma medição animal vivo todo quantitativa para a permeabilidade do cérebro de zebrafish embrionário. A técnica de análise da capacidade de retenção de fluido cerebrospinal e moléculas de diferentes pesos moleculares no interior do lúmen do tubo neural e quantifica o seu movimento para fora dos ventrículos. Este método é útil para a determinação de diferenças de permeabilidade epitelial e maturação durante o desenvolvimento e na doença.

Resumo

O sistema ventricular do cérebro é conservada entre vertebrados e é composto de uma série de cavidades interconectadas chamado ventrículos cerebrais, os quais formam, durante as primeiras fases do desenvolvimento do cérebro e são mantidas durante toda a vida do animal. O sistema ventricular do cérebro é encontrado em vertebrados, e os ventrículos se desenvolver após a formação do tubo neural, em que o lúmen central, enche-se de líquido cefalorraquidiano (LCR) ^1,2. CSF é um líquido rico em proteínas que são essenciais para o desenvolvimento do cérebro e função normais ^3-6.

No peixe-zebra, o cérebro de inflação ventrículo começa em cerca de 18 a fertilização pós hr (hpf), depois de o tubo neural está fechado. Vários processos estão associados com a formação de cérebro ventricular, incluindo a formação de um neuroepitélio, a formação da junção estanque, que regula a produção de permeabilidade e CSF. Nós mostramos que o Na, K-ATPase é necessária para a inflação do ventrículo cerebral, afectando todos estes processoses ^7,8, ao passo 5a claudina é necessário para a formação da junção estanque ^9. Além disso, mostramos que a "relaxamento" do neuroepitélio embrionário, através da inibição da miosina, está associada com a inflação do ventrículo cerebral.

Para investigar a regulação da permeabilidade durante zebrafish inflação ventrículo cerebral, foi desenvolvido um ensaio ventricular retenção de corante. Este método utiliza a injecção ventrículo cerebral em um embrião do peixe-zebra vivos, uma técnica anteriormente desenvolvido no nosso laboratório ^10, a fluorescência rotular o fluido cerebrospinal. Os embriões são então trabalhada ao longo do tempo à medida que o corante fluorescente, através dos ventrículos cerebrais e neuroepitélio. A distância da frente de corante se afasta do basal (não luminal) do lado do neuroepitélio ao longo do tempo é quantificado e é uma medida da permeabilidade neuroepitelial (Figura 1). Observamos que corantes 70 kDa e menores vão percorrer a neuroepitélio e pode ser detected fora do cérebro embrionário do peixe-zebra a 24 hpf (Figura 2).

Este ensaio de retenção de corante pode ser usada para analisar a permeabilidade neuroepitelial em uma variedade de diferentes origens genéticas, em momentos diferentes durante o desenvolvimento, e após perturbações ambientais. Também pode ser útil para examinar a acumulação patológica de CSF. No geral, esta técnica permite aos pesquisadores analisar o papel e regulação da permeabilidade durante o desenvolvimento e doença.

Protocolo

1. Preparando-se para microinjeção

1. Prepare agulhas microinjeção puxando tubos capilares utilizando Sutter extrator agulha instrumentos.
2. Agulha de microinjecção de carga com corante fluorescente (FITC-dextrano).
3. Montar a agulha no aparelho micromanipulador e microinjecção.
4. Cuidadosamente quebrar agulha microinjeção usando uma pinça para cerca de 2 m de largura, no entanto, isso vai variar dependendo da configuração do microinjetor. Para agulhas nossos microinjecção, esta corresponde à primeira região da agulha a partir da ponta, que não se curva.
5. Medir o tamanho da gota de óleo, ajustando o tempo de injecção e pressão, de modo que cada um proporciona uma injecção nl. Definições de exemplo para Harvard Apparatus microinjetor são: P = 1,4 psi equilíbrio, P = 1,4 psi fora, P = 22,9 psi injetar, P = 67,8 psi claras com um tempo de injeção de 0,4-0,7 seg. O diâmetro da nossa agulha usando essas configurações é de aproximadamente 2 m. No entanto, as definições serão microinjetor específico, e variamegundo a agulha de diâmetro.

2. Preparando os embriões

1. Revestimento de dois pratos com agarose a 1% em água, para cada condição, furos puxão em agarose com uma ponta de pipeta de 1-200 uL, e remover tampões de agarose. Preencha pratos com a mídia de embriões.
2. Usando pinça, embriões dechorionate que são 18 hpf ou mais sob estereomicroscópio. Embriões são encenadas de acordo com Kimmel et al. ^11.
3. Transferência de embriões dechorionated no prato agarose primeiro revestido.
4. Para anestesiar os embriões, adicionar tricaina (0,1 mg / ml) para o prato até embriões parar de se mover (feito de acordo com Westerfield ^12).

3. Injetando os ventrículos cerebrais

1. Embriões orientar para que você está olhando para o seu lado dorsal, colocando a cauda do embrião dentro do buraco. Se o micromanipulador está do lado direito, em seguida, deslocar o embrião de modo que o prosencéfalo é para a esquerda e para a direita rombencéfalo.
2. Posição da agulha ao widest ponto de ventrículo rombencéfalo.
3. Cuidadosamente placa telhado perfurar do ventrículo rombencéfalo tendo a certeza de não passar a profundidade do cérebro para a gema (Figura 1A).
4. Injectar 1-2 nl de corante fluorescente para os ventrículos, certificando-se que o corante enche todo o comprimento dos ventrículos do cérebro.
5. Transferir os embriões para o prato agarose segundo revestido cheio com meios de embriões e re-anestesiar como descrito em 2.4.
6. Começar imediatamente a imagem, como descrito na seção 4, a fim de obter uma imagem tempo zero.

4. Imagem

1. Embriões orientar com sua cauda no buraco, como descrito em 3.1.
2. Use um microscópio de dissecação com luz fluorescente e transmitida tanto para obter uma imagem dorsal campo claro. Mantenha a ampliação constante entre imagiologia de embriões diferentes. Isto permite a comparação direta de análises realizadas utilizando Image J (5,2-6).
3. Sem mover o embrião microscópio, ou prato, dê umaimagem fluorescente correspondente.
4. Repetir para cada embrião em pontos de tempo desejados.

5. Quantificação de Movimento Dye

1. Fundir de campo claro e as imagens fluorescentes em Photoshop como anteriormente descrito por Gutzman e Sive ^10.
2. Medir a distância os movimentos frente de corante no software Image J disponível em http://rsbweb.nih.gov/ij/ .
3. Arquivo mesclado aberto no Image J e use a ferramenta de linha para desenhar uma linha do prosencéfalo dobradiça ponto-a-tingir frente em um ângulo de 10-20 ° de neuroepitélio (Figura 1A). Esta região foi escolhida por ser o primeiro local e mais notável de corante vazar do neuroepitélio de tipo selvagem.
4. Selecione a ferramenta de medição para calcular o comprimento da linha.
5. Repetir para cada ponto do tempo.
6. Calcular a distância a frente de corante líquido movido ao longo do tempo, subtraindo a distância em t = 0 a partir de outros pontos de tempo.
7. Lote emgráfico.

6. Resultados representativos

Um exemplo dos resultados obtidos num ensaio de permeabilidade utilizando embriões neuroepitelial do tipo selvagem é mostrada na Figura 1B, D-. Para diferenciar com precisão da permeabilidade, que é útil para testar os corantes com weightsto molecular diferente identificar um tamanho que é apenas ligeiramente permeável de tipo selvagem ou de embriões de controlo (Figura 2). Isto permite a identificação de mutantes genéticos ou condições ambientais que, ou aumento ou diminuição de permeabilidade (Figura 1D, verde e vermelho, respectivamente, de linhas). Para o neuroepitélio zebrafish 24 hpf, 70 kDa vazamentos FITC Dextran lentamente ao longo de 2 horas, enquanto 2.000 kDa não faz e 10 kDa quase imediatamente vaza. Portanto 70 kDa é o peso ideal molecular para identificar as condições que tanto aumentar e diminuir a permeabilidade neuroepitelial.

Se a agulha falha do lúmen do ventrículo, a fluorescência wmal aparecem fora do cérebro em t = 0 (para um exemplo veja Gutzman e Sive, 2009 ^10). Estes embriões devem ser eliminados uma vez que a tinta não foi injectado inicialmente contido no interior do cérebro e nenhuma conclusão clara sobre o movimento do corante e permeabilidade da neuropeithelium podem ser feitas.

Finalmente, se os embriões têm ventrículos pequenos ou ventrículos cerebrais un-inflados, pré-injecção dos ventrículos com uma solução salina pode ser feito antes da injecção do corante fluorescente. Isto faz a insuflação dos ventrículos tornando visualização posterior dos ventrículos mais fácil quando se injecta com o corante fluorescente. Controlos apropriados devem ser realizados para determinar se a injecção de uma solução salina normal, interrompe o desenvolvimento do tubo neural.

Figura 1. Curso de tempo de diferentes corantes de peso molecular. (A) Diagrama Experimental. Primeiro, Corante fluorescente é injetado nos ventrículos. X = posição de agulha para injecção. Próxima imagens dorsais são capturados ao longo do tempo. Finalmente, a distância percorrida pela frente do corante a partir do prosencéfalo dobradiça ponto é medida (representada por uma linha vermelha). (BC) Incorporada campo claro e fluorescentes imagens dorsal a 22 hpf (t = 0 min, B) e 24 hpf (t = 120 min, C). Linha branca indica a distância da frente de corante do cérebro anterior do ventrículo. (D) de dados de permeabilidade hipotéticos amostra. Azul = tipo selvagem ou controles, vermelho = amostra com permeabilidade diminuiu em relação ao controle, e amostra verde = com permeabilidade aumentada em relação ao controle.

Figura 2. Medição da permeabilidade de diferentes corantes neuroepitelial peso molecular. (AE) brightfield Dorsal resultante da fusão e as imagens fluorescentes de 22 HPF embriões de tipo selvagem em t = 0 min após a injecção, com FITC-dExtran dos pesos moleculares seguintes: 10 kDa (A), 40 kDa (B), 70 kDa (C), 500 kDa (D) e de 2.000 kDa (E). (A'-E ') O mesmo que no embrião (AE) em t = 120 min a 24 hpf. Anterior para a esquerda. F = prosencéfalo, M = mesencéfalo, H = rombencéfalo. Asterisco = orelha.

Discussão

Nós demonstrar a capacidade de quantificar a permeabilidade do cérebro embrionário do peixe-zebra vivos, tal como determinado por um corante injectado de um determinado peso molecular. A nossa observação de que o neuroepitélio zebrafish embrionária é diferencialmente permeável aos corantes de diferentes pesos moleculares sugere que o corante está a avançar através da permeabilidade paracelular. No entanto, não podemos descartar a possibilidade de uma contribuição para a permeabilidade transcelular observa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Dextrano, fluoresceína, Anionic, Lisina fixável	Invitrogen	D7136, D7137, D1822, D1820, D1845
Tricaina pó	Sigma	A5040
Tubos capilares	FHC Inc.	30-30-1