Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

Resumo

Para estudar o mutualismo entre Xenorhabdus Bactérias e Steinernema Nemátodos, foram desenvolvidos métodos para monitorizar a presença de bactérias e localização no interior de nemátodos. A abordagem experimental, a qual pode ser aplicada a outros sistemas, implica bactérias engenharia para expressar a proteína fluorescente verde e visualização, por meio de bactérias de microscopia de fluorescência dentro do nemátodo transparente.

Resumo

Simbioses, a convivência de dois ou mais organismos, são comuns em todos os reinos da vida. Como dois dos organismos mais ubíquos na Terra, nemátodos e bactérias formam uma grande variedade de associações simbióticas que vão desde benéfico para patogénico ^1-3. Uma associação como é o relacionamento mutuamente benéfico entre as bactérias e nematóides Steinernema Xenorhabdus, que emergiu como um sistema modelo de simbiose ^4. Nematóides entomopatogênicos Steinernema são, usando seu simbionte bacteriano para matar insetos ^5. Para a transmissão entre os hospedeiros de insetos, as bactérias colonizam o intestino do nematóide juvenil fase infecciosa ^6-8. Recentemente, várias outras espécies de nematóides foram mostrados para utilizar as bactérias para matar insectos ^9-13, e começaram investigações examinar as interacções entre os nemátodos e bactérias nestes sistemas <sup> 9.

Descreve-se um método para a visualização de um simbionte bacteriano dentro ou sobre um hospedeiro de nematóides, tirando partido da transparência óptica de nemátodos, quando vistas através de microscopia. As bactérias são manipuladas para expressar uma proteína fluorescente, permitindo a sua visualização por microscopia de fluorescência. Estão disponíveis muitos plasmídeos que transportam genes que codificam proteínas que fluorescem a diferentes comprimentos de onda (ou seja, verde ou vermelha), e de conjugação de plasmídeos a partir de uma estirpe de Escherichia coli doador em um receptor symbiont bacteriana é bem sucedida para uma ampla gama de bactérias. Os métodos descritos foram desenvolvidos para investigar a associação entre Steinernema carpocapsae e nematophila Xenorhabdus ^14. Métodos semelhantes têm sido utilizados para investigar outros nematóides bactéria associações de ^{9, 15-18} e, portanto, o método é geralmente aplicável.

O Method permite a caracterização da presença de bactérias e de localização dentro de nemátodos em diferentes fases de desenvolvimento, proporcionando insights sobre a natureza da associação e do processo de colonização ^{14, 16, 19.} A análise microscópica revela tanto a frequência dentro de uma população de colonização e localização de bactérias aos tecidos do hospedeiro ^{14, 16, 19-21.} Esta é uma vantagem sobre os outros métodos de monitorização de bactérias dentro das populações de nematóides, tais como a sonicação ou a trituração ^{22 23,} o qual pode fornecer níveis médios de colonização, mas não pode, por exemplo, discriminar populações com uma alta frequência de baixa carga simbióticas de populações com uma baixa freqüência de cargas simbióticas elevados. Discriminando a freqüência ea carga de bactérias colonizadoras pode ser especialmente importante quando a seleção ou caracterização de bactérias mutantes para os fenótipos de colonização ^{21, 24.} Com efeito, a microscopia de fluorescência tem sido utilizada na pesquisa de alto rendimento de mutantes bacterianos para defeitos de colonização ^{17, 18,} ​​e é menos trabalhosa do que outros métodos, incluindo a sonicação ^{22, 25-27} e dissecção de nemátodos individuais ^{28, 29.}

Protocolo

1. Construção de uma estirpe bacteriana fluorescente via Conjugação

1. Crescer a estirpe receptora (symbiont a ser examinada), e estirpe dadora durante a noite. A estirpe dadora, Escherichia coli, geralmente, deve ser capaz de doar DNA através de conjugação e deve ser transformada com uma. Plasmídeo (Tabela 2), que transporta um gene que codifica uma proteína fluorescente Dependendo do plasmídeo, de uma estirpe ajudante de conjugação também podem ser necessários. Se for assim, esta estirpe deve também ser cultivadas durante a noite. A estirpe dadora e tensão auxiliar devem ser cultivadas com antibióticos para seleccionar para a manutenção do plasmídeo.
2. Subcultura do doador, ajudante e estirpes receptoras em nutrientes ricos meios de crescimento que faltam antibióticos em uma proporção de 1:100 da cultura para médio.
3. Crescer as culturas à temperatura adequada para cada estirpe, até que eles atinjam mid-log de ​​crescimento fase (OD ₆₀₀ ~ 0,6). Para Xenorhabdus e E. coli nesta fase de crescimentoth é atingido cerca de 3-4 horas após a repicagem. Isto pode variar dependendo da estirpe, ou em alguns casos o plasmídeo, utilizado.
4. Misturar as estirpes num tubo de microcentrifugação e centrifugar durante 2 minutos a 17900 xg (13000 rpm, na maioria dos microfuges). A proporção do dador e do receptor que produz melhores resultados irão variar para diferentes combinações, e pode ter que ser determinadas empiricamente. Para um destinatário Xenorhabdus e E. doador coli, usamos um 3:1 ou 1:1. Se uma tensão auxiliar é necessária (por exemplo, E. coli), que deve ser adicionada na mesma proporção que o doador.
5. Decantar o sobrenadante.
6. Re-suspender o sedimento celular em 30 ul de meio fresco.
7. Detectar a suspensão sobre uma placa de meio nutriente rico sem quaisquer antibióticos, e permitir que o local para secar.
8. Incubar a placa, invertido, durante a noite a uma temperatura óptima para a bactéria receptora e admissível do doador (e auxiliar, se for o caso). A placa deveser incubado, pelo menos, 18 horas.
9. Raspe a mancha e raia para colónias isoladas em uma placa seletivo antibiótico. Os antibióticos devem seleccionar contra o dador e para o receptor contendo o plasmídeo. Uma ou duas faixas de isolamento adicional pode ser necessário isolar uma cultura pura.
10. Assegurar as colónias resultantes são simbiontes do destinatário, e não a estirpe doadora, por rastreio quanto à presença de fenótipos receptores específicos, tais como morfologia das colónias, ou detecção de PCR de genes específicos de receptor. Rastrear as colónias para a presença do plasmídeo por reacção de polimerização em cadeia de uma sequência conhecida do plasmídeo e de fluorescência. As colónias devem fluorescência sob o comprimento de onda correcto correspondente à proteína fluorescente.

2. Produção de ovos de nematóides axênicas

1. Crescer 5 ml do simbionte bacteriano natural durante a noite. Para iniciar uma cultura, as bactérias podem ser inoculadas em lisogenia Broth (LB) ou cu outrosLTURE mídia diretamente de um estoque congelador ou de uma placa de raia.
2. Espalhar 600 ul da cultura bacteriana para 10 milímetros Lipid Agar (LA) placas ^29. Oito a dez placas produzirá nemátodos suficiente para a maioria das espécies.
3. Incubar no escuro, sem humidade, a 25 ° C durante dois dias.
4. Adicionar 5000 nemátodos infective juvenil, ou outras fases, dependendo do nemátodo ser utilizado, em 500 ul de meios de comunicação para os relvados bacterianas. Incubar as placas a 25 ° C durante 3 dias.
5. Verifique se o seu placas para a presença de nematóides adultos e ovos. Colocar 20 uL de água sobre uma lâmina de microscópio. Usando uma vara estéril scrape-se uma pequena quantidade de nemátodos a partir da camada bacteriana. Coloque a vara para a água e permitem que os nemátodes para nadar. Olhe para o seu slide em pequeno aumento. Para mais informações sobre a aparência ver a discussão e Figura 2.
6. Se os ovos e as fêmeas são visíveis, continuar, caso contrário, incubar as placas a 25 & dpor exemplo, C e verificar para o desenvolvimento adequado a cada hora 6-12. Quando as fêmeas contêm ovos, colocar alguns ml de água sobre a superfície das placas. Agite cuidadosamente as placas e despeje a água em um tubo de 50 ml cônico. Nematóides deve soltar-se das placas e deixa de estar visível na superfície da placa. Várias lavagens podem ser necessárias.
7. Permitir que os nemátodos se depositem no fundo do tubo.
8. Enxaguar nematóides. Pipetar o excesso de água a partir da parte superior do tubo. Encher com água limpa e deixar nematóides adultos para resolver. Pipetar o excesso de água.
9. Encha os tubos cônicos com solução ovo. Assim solução ovo é adicionado o tempo de todas as etapas com a solução ovo deve proceder exatamente como descrito para produção de ovos máximo. Incubar os tubos enquanto agitando por exatamente 10 minutos. A maioria dos nematóides deve ser dissolvida no final da incubação.
10. Imediatamente centrifugar os tubos cónicos a 1250 xg, durante exactamente 10 min (o que inclui o trazer até a velocidade de centrifugaçãomas não para baixo como 0 x g. Use o freio).
11. Decantar o sobrenadante.
12. Imediatamente re-suspender o sedimento com uma solução de ovo por pipetagem.
13. Imediatamente preencher tubo cônico com solução de ovo e misture bem, invertendo 3-5 vezes. Então, imediatamente, girar como em 2.10.
14. Decantar o sobrenadante.
15. Re-suspender o sedimento em LB por pipetagem, transferir para um tubo cónico de 15 ml de granulação melhorada durante as etapas de lavagem. LB é um padrão para Steinernema spp. Outros tampões (por exemplo, um meio de sais mínimo) pode ser utilizado, dependendo do nemátodo e bactéria, tendo em mente o tampão não deve prejudicar tanto o nemátodo ou uma bactéria.
16. Encha o tubo com LB e rotação como em 2.10.
17. Decantar o sobrenadante e re-suspensão em LB.
18. Enxaguar os nemátodos com um total de 3 vezes, repetindo 2.14 e 2.15.
19. Diluir os ovos re-suspensão de nemátodes para um volume apropriado. Deve haver, pelo menos, 10 ovos por microlitro. Por exemplogs podem ser armazenadas numa caixa de Petri de 6 cm em 5 ml de LB durante pelo menos quatro dias por adição de antibióticos que inibem o crescimento de bactérias colonizadoras e envolvendo o prato em parafilme. Os ovos terá de ser lavado uma vez em 15 ml de LB (como em 2.13 e 2.14) antes da inoculação em relvados bacterianas. Note-se que os ovos eclodem durante este tempo e não podem ser sincronizados developmentally quando utilizados em ensaios de colonização.

3. Ensaio de co-cultivo com bactérias fluorescentes

1. Crescer bactérias fluorescentes durante a noite, a selecção para o plasmídeo, se necessário.
2. Espalhar 600 ul da cultura bacteriana para 10 milímetros placas de Ágar de lípidos com uma vara estéril. Incubar a 25 ° C durante 2 dias.
3. Lugar 500-5,000 ovos de nematóides axênicas em um total de 100 a 400 ul (2,000 optimamente nematóides em 200 ul) em cada placa de agar de lípidos.
4. Incubar no escuro, sem umidade a 25 ° C até JIs, ou outras etapas do formulário de interesse. JIs será visível como uma fuanel branco zzy na borda do prato. Olhar para outras fases da vida, ver o Protocolo 4.
5. Colocar as placas em uma armadilha branco modificado ^30. Remover a tampa da placa de agar de lípidos e colocar a parte inferior para a parte inferior de um vazio 100 milímetros x 20 mm de prato de Petri. Encher a caixa de Petri grande, com água, ou outro tampão apropriado para o seu nemátodo, a rodear a pequena placa. O nível de água deve ser de cerca de metade da altura da pequena placa.
6. Incubar a armadilha de água até JIs progênie surgiram no buffer.
7. Nemátodos juvenis infecciosos podem ser armazenadas em água, num balão de cultura de tecidos.

4. Recolha de fases iniciais de vida para Triagem

1. Use os passos 3.1 a 3.4 para configurar o ensaio.
2. Incubar as placas até que as fases de vida desejados estão presentes. Inspecção visual diária pode ser necessário determinar o timing. Para inspecionar as placas, utilize o procedimento descrito no protocolo 2.5. Para S. carpocapsae eggsgrown com X. nematophila em placas de LA, fêmeas grávidas estará presente em 4-5 dias, juvenis estará presente em 7 dias, e juvenis infectantes vai começar a ser produzida por 15-17 dias.
3. Quando as fases da vida desejadas estão presentes, recolher a sua amostra. Encher um poço de uma placa de 96 poços com 200 ul de PBS ou outro tampão apropriado. Raspe fora algum do gramado bacteriana que contém nematóides. A quantidade do tamanho de ervilha (~ 50 mg) irá fornecer, pelo menos, várias centenas de nemátodos vez descendência F1 são produzidos, mas pode ser necessário mais para momentos anteriores. Coloque a vareta no buffer assim que o contém.
4. Incubar por 30 segundos a um minuto. Retire o pau e raspe o resíduo restante. Use a vara para remover qualquer agar a partir do poço. Os nematodes deve ser visível no interior do tampão. Movimentar a mistura de tampão para um tubo de microcentrífuga limpo.
5. Trate os nematóides com levamisol ou outro agente paralisante. Dissolver alguns grãos de levamisol em 30 & mu; L de água. Adicionar 1-2 ul desta mistura para cada um 50 ul de amostra. Após o tratamento com levamisole os nemátodos serão não-viáveis.
6. Se as amostras será visto posteriormente, fixar, tal como descrito neste passo. Se não, pule para o passo 4.6. Adicionar 200 ul de solução fixadora contendo 1X tampão e paraformaldeído a 4%. Misture delicadamente, pipetagem pode causar fases da vida delicados para lisar. Cubra com folha e incube à temperatura ambiente num agitador de baixo, pelo menos, 18 horas.
7. Colocar os tubos num suporte de tubos, e permitir que os nemátodos se depositem no fundo do tubo.
8. Enxaguar nemátodos para remover o fundo. Pipetar fora o excesso de líquido e adicione 200-500 ul de tampão e misturar suavemente. Repetir. Isto pode ser repetido várias vezes para remover mais fundo, se desejado.
9. Permitir que os nemátodos se depositem no fundo do tubo e suspender novamente no volume desejado.
10. Se os nemátodes não são fixos tela, imediatamente. Nematóides fixas podem ser armazenadas no frigorífico durantea duas semanas. Armazenar no escuro.

5. Nematóides de triagem para Associação bacteriana por Microscopia

1. Seleccionar alguns nematóides para ver sob o microscópio através da remoção de uma pequena amostra de sua mistura.
2. Para garantir que os nemátodos são ainda para a imagem, tratar com um agente paralisante, conforme descrito no protocolo 4.5. Se você não estiver tirando uma foto ou os nematóides já estão corrigidos, este passo pode ser ignorado.
3. Adicionar 20-30 ul de nematóides em água para a sua lâmina de microscópio e uma lamela por cima.
4. Ver nematóides inteiros, utilizando microscopia de luz para garantir os nemátodos estão no campo de visão.
5. Ver nemátodos usando a configuração no microscópio de fluorescência, que corresponde à fluorescência expressa pelas bactérias.
6. Para identificar a localização bacteriana, tirar fotos do nematóide, em configuração fluorescente e um cenário de microscopia de luz, e em seguida sobrepor as imagens. As fotos precisam ser do mesmo field de vista. Pode ser necessário tentar várias ampliações e vistas do nemátodo de encontrar as bactérias.
7. A distribuição de colonização nemátodo pode ser quantificada por meio da contagem de uma população de nematóides, para marcar a presença ou ausência de bactérias, e calculando a percentagem colonizado. Recomendamos a contagem até que pelo menos 30 nemátodos dentro da população são contados em cada uma das categorias (com ou sem a colonização), para obter um valor de confiança.
8. Quando apenas uns poucos nemátodos na população são colonizados, pode ser necessário dispor vários milhares de nemátodos Antes de 30 são observados. Para alto rendimento contagem utilize os seguintes passos.
9. Em vez de contar os nemátodes individualmente aliquota, a população em uma placa de multi-poços (por exemplo, uma placa de 24 cavidades). Após os nematóides foram para o fundo do prato, cada cavidade podem ser digitalizados no microscópio e o número de nemátodos colonizadas podem ser marcados.
10. O número total de nemátodos ind população pode ser identificado por diluições em série de nematóides no poço. Por exemplo, 1 ml de nemátodos podem ser adicionados a um poço, misturou-se bem, por agitação com uma ponta de pipeta, e 3 ul podem ser retirados e contados para a quantificação da população total no poço.
11. A percentagem de nemátodos colonizadas podem ser obtidos através da divisão do número colonizado pelo número total de nemátodos no poço.

6. Resultados representativos

Exemplo, imagens de microscopia de nemátodos Steinernema associados com bactérias Xenorhabdus são mostrados na Figura 3. Para criar a imagem composta visto na Figura 3A, uma imagem de contraste de fase foi sobreposto com uma imagem de fluorescência. A seta na Figura 3A indica as bactérias presentes no interior do nemátodo infective juvenile (barra = 100 um). Figura 3B foi construído de uma forma semelhante e descreve um nematóide juvenil wiTH Green bactérias proteínas fluorescentes marcados (barras verdes) localizadas ao longo do lúmen nematóides intestinais (barra = 20 um). Uma população de nematóides de dois meios foram contados e marcados para a colonização por bactérias simbiontes (Tabela 1). Para dados estatísticos robustos, é melhor para contar pelo menos 100 nematóides por exemplo com pelo menos 30 a cair em cada categoria. Como pode ser visto na Tabela 1, estes nemátodos são colonizados a um nível de cerca de 14,6%, quando cultivada em agar de lípidos e de 68,6% quando cultivadas em agar de rim fígado. Nematóides e outras espécies bacterianas têm sido demonstrado que têm diferentes níveis de colonização. Por exemplo X. nematophila coloniza 99% de S. carpocapsae juvenis infectantes (Martens, 2003) e P. luminescens coloniza 26% de H. juvenis infectantes bacteriophora Ciche (2003).

Figura 1. Esboço esquemático do método. A. A bactéria é manipulada para expressar uma proteína fluorescente. Ovos de nematóides B. são isoladas a partir de nemátodos adultos para produzir nemátodos esterilizados. C. Os nemátodos esterilizados são co-cultivadas com as bactérias fluorescentes. D. Os estágios de vida resultantes são vistas sob um microscópio para avaliação da presença de bactérias no interior do nematóide.

Figura 2. Representação de mulheres adultas que contenham ovos. A. O esquema mostra a aparência geral de fêmeas Steinernema. Detalhe: imagem DIC de um S. feltiae gravid fêmea. A seta preta indica a vulva. As setas brancas mostram ovos visíveis. A imagem está com ampliação de 20x, ea barra de escala representa 100 mm. B. imagem DIC de um S. desenvolvido, mas unhatchedfeltiae ovo nematóide. Imagem é a ampliação de 40 vezes, ea barra de escala representa 50 mm. C. imagem DIC de ovos isolados de S. feltiae nematóides com a ampliação de 10X. Barra de escala é 100 mm.

Figura 3. Exemplo imagens de microscopia de nematóide-bacteriana associação. A. S. nematóides puntauvense foram associados com a sua symbiont bacteriana, X. bovienii GFP, expressar. A imagem é uma imagem composta produzida através da sobreposição de uma imagem de contraste de fase com uma imagem fluorescente a partir do mesmo campo de visão. A seta indica o simbionte fluorescente dentro do hospedeiro bacteriano nematóide. Barra de escala representa 100 mm. B. Esta imagem mostra um S. carpocapsae nemátodos juvenis com GFP-expressando X. nematophila localizadas no interior do intestino nematóide.Esta imagem foi construída através da sobreposição de uma imagem sobre uma imagem de fluorescência de contraste de interferência diferencial. A barra de escala representa 20 m.

Tensão	Número de Nematóides Com acteria	Nematóides total contado	Por cento dos nemátodos olonized
S. Agar Lipid puntauvense	30	205	14,60%
S. puntauvense Agar Fígado Rim	72	105	68,60%

Tabela 1. Scoring exemplo de uma população de nemátodos para presença bacteriana. Nesta experiência, axénica S. nemátodos foram cultivados com puntauvense seu simbionte expressando GFP-em diferentes meios de cultura (agar agar lipídico e fígado, rim ³²⁾ para testar quanto a defeitos de colonização. Um total de pelo menos um hundred nematóides por amostra foram contados e marcados para detectar a presença de bactérias. Para poder estatístico, três réplicas experimental deve ser contado com pelo menos 30 nematóides correspondentes a cada categoria.

Tabela 2. Os plasmídeos contendo a proteína fluorescente. Uma lista de potenciais plasmídeos para a inserção de uma proteína fluorescente na symbiont bacteriana é dado listado pelo nome de plasmídeo. Outras informações incluídas são a proteína fluorescente cassete, codificado antibiótico utilizado para a manutenção do plasmídeo, as outras instruções de utilização, a origem do plasmídeo. A concentração indicado entre parênteses é a concentração do antibiótico utilizado para X. nematophila. Cada um destes plasmídeos foi utilizada com sucesso em ambos Xenorhabdus ou Photorhabdus. Informações adicionais podem ser obtidas a partir de citações anotadas. Dependendosobre a bactéria a ser testado, alguns plasmídeos podem não funcionar com base na proteína fluorescente, a selecção de antibiótico, do local de inserção, ou de origem de replicação. Os plasmídeos acima mencionados contêm características diferentes que podem permitir a utilização na bactéria de interesse. Por exemplo, os mini-Tn7-KSGFP insere no sítio attTn7 do cromossoma, enquanto pECM20 insere no X. nematophila cromossoma por recombinação homóloga. Alternativamente, os plasmídeos são mantidos extracromossomicamente pPROBE, e cada pPROBE plasmídeo tem a mesma espinha dorsal e fluoróforo mas têm diferentes marcadores seleccionáveis ​​e origens de replicação que permitem a sua utilização numa variedade de origens taxonómico ou mutantes.

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Discussão

O protocolo aqui descrito proporciona um método para a detecção óptica de bactérias dentro de um hospedeiro de nemátodos (Figura 1). Este método tira vantagem da transparência óptica dos nemátodos e a capacidade de bactérias fluorescentes de etiquetas, permitindo a análise in vivo das bactérias dentro do hospedeiro nematóide (Figura 3). Especificamente, esta abordagem identifica a localização de bactérias dentro de seu hospedeiro. Ao contar uma popula?...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Agar lipídico (Estéril)			8 gramas de caldo nutriente, 15 gramas de agar de extracto de levedura, 5 gramas de água, 890 ml, 10 ml 0,2 g / ml de MgCl2. 6H 2 0, 96 ml de solução de xarope de milho *, 4 ml de óleo de milho * Mexa mídia ao derramar placas * Adicionar ingrediente estéril após a autoclavagem
Solução Xarope de milho (Estéril)			7 ml de xarope de milho, 89 ml de água mistura e autoclave
Solução ovo			16,6 ml de hipoclorito de sódio a 12%, 5 ml de KOH 5M, 80 ml de água
Lisogenia Caldo (Estéril)			5 gramas de extrato de levedura, triptona 10 gramas, 5 gramas de sal, 1 L de água mistura e autoclave
Microcentrifugue	Pescador	13-100-675	Qualquer microcentrífuga que contém tubos de microcentrífuga funcionará
Centrifugador	Beckman	366802	Centrífuga de topo grande tabela que contém 15 ml e 50 ml, tubos cónicos
Estéril 60 mm x 15 milímetros prato de Petri	Pescador	0875713
50 ml tubos de centrífuga	Pescador	05-539-6
15 ml tubos de centrífuga	Pescador	05-531-6
Estéril 100 mm x 20 milímetros prato de Petri	Pescador	0875711Z	Mais profundo do padrão pratos de Petri
Placa de 24 poços	Greiner Bio-One	662000-06
Microscópio			O microscópio fluorescente necessita de capacidades compatíveis com o fluoróforo
Paraformaldeído	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (Estéril)			8 g de NaCl 0,2 g de KCL 1,44 g de Na 2 HPO 4 0,24 g de KH 2 PO 4 1 L de água Ajustar a um pH de 7,4 e 1 L de água a autoclave e
Tubos de microcentrífuga	Pescador	05-408-138	2 ml ou 1,5 ml tubos
Sacudidor			Qualquer agitador que faz com que o líquido se mova suavemente vai trabalhar
Ácido Diaminopimélico	Sigma	D-1377	Se for necessário, meios de comunicação para completar uma concentração de 1 mM ou