Usando RNA mediada estratégia de alimentação Interferência em tela para genes envolvidos na regulação do tamanho corporal na Nemátodo<em&gt; C. elegans</em

Resumo

Nós demonstramos como usar a técnica de alimentação RNAi para derrubar genes-alvo e pontuação fenótipo tamanho do corpo C. elegans. Este método poderia ser utilizado para um ecrã de grande escala para identificar potenciais componentes genéticos de interesse, tais como aqueles que estão envolvidos na regulação do tamanho do corpo por sinalização DBL-1/TGF-β.

Resumo

Double-strand RNA de interferência mediada (RNAi) é uma estratégia eficaz para derrubar alvo de expressão gênica ^1-3. Ele foi aplicado a muitos sistemas de modelos, incluindo plantas, invertebrados e vertebrados. Existem vários métodos para atingir RNAi in vivo ^4,5. Por exemplo, o gene alvo pode ser transformado em um vetor de RNAi, e, em seguida, de forma permanente ou transitória transformado em linhas celulares ou células primárias para alcançar efeitos knockdown do gene, alternativamente sintetizados oligonucleótidos de cadeia dupla a partir de genes alvo específicos (RNAi oligos) pode ser transitoriamente transformadas em linhas celulares ou células primárias de silenciar genes alvo, ou sintetizados moléculas de ARN de cadeia dupla pode ser microinjectado num organismo. Uma vez que o nemátodo C. elegans usa bactérias como fonte de alimento, a alimentação dos animais com bactérias expressando RNA de cadeia dupla contra genes alvo proporciona uma estratégia viável ^6. Aqui apresentamos uma alimentação RNAimétodo para marcar fenótipo tamanho do corpo. Tamanho do corpo em C. elegans é regulado principalmente pelo TGF-β - ligante como DBL-1, de modo que este ensaio é adequado para a identificação de TGF-β componentes de sinalização ^7. Usamos diferentes cepas incluindo duas linhagens de RNAi hipersensíveis repetir os experimentos de alimentação de RNAi. Nossos resultados mostraram que RRF-3 tensão nos deu o melhor fenótipo RNAi esperado. O método é de fácil execução, reprodutível e facilmente quantificada. Além disso, o nosso protocolo minimiza o uso de equipamento especializado, pelo que é adequado para laboratórios menores ou aqueles em instituições predominantemente de graduação.

Protocolo

1. Preparando Placas de alimentação RNAi de transporte sequência do gene alvo

1. Se o uso de bibliotecas disponíveis comercialmente RNAi (por exemplo, de LifeSciences Fonte BioScience), vá para o passo 1.4. Alternativamente, clonar seqüências de genes-alvo em vetor L4440, um worm comumente usado RNAi plasmídeo ^8, por meio de protocolo de clonagem padrão.
2. Transformar o plasmídeo recombinante na estirpe bacteriana HT115 (DE3), a cultura deles em placas de agar LB com 25 ug / ml de carbenicilina e 12,5 ug / ml de tetraciclina, e escolher um único clone para uso futuro.
3. Enquanto isso, transforma o vector vazio L4440 na estirpe bacteriana HT115 para usar como um controlo para as experiências.
4. Cultura tanto recombinantes e vazio L4440-transportam bactérias em 1 ml de caldo LB com 100 ug / ml de ampicilina durante a noite a 37 ° C. Tetraciclina não é adicionado devido ao fato de que ela diminui a eficiência RNAi.
5. Adicionar mais 5 ml de caldo LB com 100 ug / ml de ampicilina durante a noite para a culture, incubar por mais 4-6 horas a 37 ° C.
6. Semente de 0,5 ml recombinante ou vazio L4440 de transporte de cultura bacteriana sobre as placas sem-fim de RNAi. Rotular todas as placas com o nome de clone.
7. Marcar as placas e incubar durante a noite a 37 ° C para crescer camada bacteriana, que são as placas de RNAi com ou sem sequência do gene alvo. Pelo menos duas chapas devem estar preparados para cada condição.

2. Worms cultura nas placas de alimentação RNAi

1. Chama esterilizar a ponta de uma pick verme platina fio. Usar o verme escolher para escolher 6-10 quarta fase larval (L4) para cada placa hermafroditas RNAi que contém L4440 ou recombinante ou vazio, os animais irão utilizar as bactérias como uma fonte de alimento.
2. Deixe hermafroditas crescer a 20 ° C (uma condição de cultura padrão para C. elegans) durante a noite, se tornarão adultos jovens no dia seguinte.
3. Transferir 6-10 jovens adultos em uma nova placa de RNAi correspondentemente rotulados e preparados.
4. Deixe oadultos põem ovos de 4-6 horas, em seguida, remover todos os adultos da placa; este passo é sincronizar a progênie. Uma vez que as mães são removidos, começar a contar o tempo. Este é o tempo zero.
5. Incubar as placas a 20 ° C para permitir que animais crescem ao estágio de desenvolvimento específico, neste protocolo, escolhemos jovens adultos para análise fenotípica. Para knockdowns que se desenvolvem a uma taxa normal, 72 h de incubação é suficiente para que os animais se tornem adultos jovens. No entanto, vários genes afectam o desenvolvimento dos animais de forma diferente. Se RNAi faz com que animais a crescer a um ritmo diferente, os jovens adultos pode ser identificada como aqueles hr não mais do que 24 passado completou L4 com desenvolvimento vulvar e 2-6 embriões no útero (se fértil). Para identificar outros estágios de desenvolvimento, o pesquisador deve usar o desenvolvimento gonadal e vulvar como um guia.

3. Fenótipos pontuação de tamanhos de RNAi Tratada Worms

1. Colocar duas camadas de fitas coloridas etiqueta sobre uma lâmina de vidro. Fazer dois doslâminas de vidro se. Em seguida, colocar uma placa de vidro novo entre as duas lâminas com fita. Melt agarose a 2% em água; aplicar uma gota para o centro da lâmina de vidro novo, em seguida, pressionar a lâmina de vidro segundo no topo para fazer uma fina camada de agarose a 2%, tal como descrito anteriormente ^9.
2. Uma vez agarose é solidificado, retire a lâmina de vidro superior, o slide com agarose almofada está pronto para carregar vermes. Slides etiqueta com o nome do clone.
3. Adicionar 10 ul de 25 mM _de NaN3 para a almofada de agarose; escolher animais 30-40 no ₃ NaN solução para imobilizá-los, em seguida, colocar a lamela na parte superior; repetição para ambos recombinante e vazio L4440 de transporte de animais tratados com RNAi.
4. Imagem os vermes sob estereomicroscópio usando lente objetiva de 2,5 x; aqui usamos Leica câmera digital com suporte Qcapture software.
5. Para a calibração, em primeiro capturar uma imagem de uma régua micrométrica standard. Em seguida, abra a imagem no Image-Pro Software, clique em "medida" e escolha "calibração" e escolha"Assistente de calibração espacial". Com a "calibrar a imagem ativa" selecionada, clique em "Avançar". Introduza o nome para a calibração e garantir que as unidades de referência espaciais estão definidas para micrômetro. Em seguida, marque a opção "criar uma referência de calibração" e clique em "Avançar". Clique em "linha de referência empate." Uma barra de escala de referência aparecerá. Mude a posição da barra de escala para combinar com as extremidades do micrômetro, em seguida, indicar que a referência indica 1.000 unidades. Clique em "OK", "Next" e "Finish".
6. Quando o software estiver calibrado, abrir uma imagem de worm. Em seguida, selecione sob a "medida" menu, selecione "calibração" e clique em "select espacial". No menu suspenso, selecione o nome do arquivo criado para a calibração do micrômetro. Então, sob a "medida" menu, selecione "medições". Na janela que se abre, selecione a ferramenta livre desenhar e traçar uma linha através do centro do corpo do animal, da cabeça à cauda com rato do computador (Figura 1). O comprimento será relatado na janela. Agoravocê tem dois grupos de dados: comprimento do corpo dos animais tratados com RNAi gene alvo e os animais controle tratados com vetor L4440 vazio.
7. Exportar as medidas de comprimento em um arquivo do Microsoft Excel, ou outro software adequado estatística. Analisar os dados através do cálculo da média e desvio padrão para cada amostra. Em seguida, compare amostras utilizando teste t de Student.

Resultados

Em nossa pesquisa, focamos na regulação do tamanho corporal pela via DBL-1/TGF-β. A perda da função dos resultados DBL-1 via de tamanho pequeno corpo, incluindo um menor comprimento de corpo comparado com animais de tipo selvagem ^7,10,11. Assim, telas para C. mutantes tamanho elegans do corpo são capazes de identificar os componentes de sinalização de TGF-β e modificadores. DBL-1 sinalização é mediada por uma via de transdução conservada TGF-β sinal que inclui os receptores da...

Discussão

Neste protocolo, descrevemos o nosso método para a identificação de mutantes defeituosos o tamanho do corpo de C. elegans alimentação por RNAi. Este método é aplicável para a identificação dos componentes de sinalização de TGF-β. Uma vez que estes componentes são altamente conservadas através da evolução ^15, tais telas são relevantes para elucidar os mecanismos moleculares de TGF-β sinalização em todos metazoários. Uma consideração importante na concepção de uma tal tela é ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Verme placas de RNAi 17,7 g Mix Médio Worm 60 g Agar Adicionar H 2 O a 3 litros. Autoclave. Adicionar 3 ml de 1M IPTG (estéril) e 3 ml de 25 mg / ml de carbenicilina (estéril), e depois verte-se sobre 60 placas de Petri milímetros. Placas de vermes 17,7 g Mix Médio Worm 0,6 g de sulfato de estreptomicina 60 g Agar Adicionar H 2 O a 3 litros. Autoclave. Despeje em 60 milímetros pratos de Petri. Mix Médio Worm 55 g de Tris-Cl 24 g de Tris-OH 310 g de Bacto Peptona 800 mg Colesterol 200 g de NaCl Misturar completamente e ter a certeza de evitar pedaços; esta mistura em pó pode ser armazenado durante muitos meses antes da utilização. 2% de agarose 0,5 g de agarose Anúnciod 25 ml dH 2 O. O calor no forno de microondas até dissolver. 1M isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 2 g IPTG Dissolver em10 mL de dH2O 1M NaN3 6,5 g de NaN3 Adicionar dH 2 O para 100 ml 25 mM de NaN3 2,5 ml de NaN3 1M Adicionar dH 2 O para 100 ml Caenorhabditis elegans de Caenorhabditis Genetics Centro L4440 plasmídeo (transporta resistência à ampicilina gene) Bactérias estirpe HT115 (DE3) (contém IPTG induzível da polimerase T7; deficiente para ARNase III gene (uma dsRNAse), que também transporta gene de resistência à tetraciclina) 16 60 milímetros placas de Petri 100 milímetros placas de Petri 14 ml de fundo redondo cultura tubos Falcon lâminas de vidro lamínulas 1-20 pipetador ul 20-200 pipetador ul 200-1000 ulpipetador 1-200 uL pontas de pipeta 200-1000 uL pontas de pipeta 1,5 ml tubos Eppendorf platina escolha verme fio