Um fluxo de trabalho de imagem de alta de conteúdo para estudar Grb2 Complexos de Sinalização por clonagem de expressão

Resumo

Um método de rastreio de alto conteúdo para a identificação de novos receptores de sinalização transmembrana competentes é descrito. Este método é passível de automatização em larga escala e permite previsões sobre In vivo Proteína de ligação e a localização sub-celular de complexos de proteínas em células de mamíferos.

Resumo

Transdução de sinal por receptores de factores de crescimento para as células é essencial para manter a proliferação e diferenciação e requer um controlo apertado. Transdução de sinal é iniciada pela ligação de um ligando a um receptor externo de transmembrana e activação de cascatas de sinalização a jusante. Um regulador-chave da sinalização mitogénica é Grb2, uma proteína modular composto por um interior de domínio SH2 (homologia src 2) ladeado por dois domínios SH3, que não tem actividade enzimática. Grb2 é constitutivamente associada com a GTPase filho da Sevenless (SOS), através do seu N-terminal SH3 domínio. O domínio SH2 de Grb2 liga-se a receptores de factor de crescimento em resíduos de tirosina fosforilados, assim, a activação do receptor de acoplamento a SOS-Ras-MAP cascata de sinalização da cinase. Além disso, outras funções para Grb2 como um regulador positivo ou negativo de sinalização e de endocitose do receptor têm sido descritas. A composição modular de Grb2 sugere que ela pode encaixar a uma variedade de receptores e transdutorese sinaliza ao longo de uma multiplicidade de diferentes vias ^1-3.

Descrita aqui é um ensaio de microscopia simples que monitora o recrutamento de Grb2 à membrana plasmática. É adaptado a partir de um ensaio que mede alterações na localização sub-celular da proteína verde fluorescente (GFP) com tag Grb2 em resposta a um estímulo ^4-6. Os receptores da membrana plasmática que se ligam tais como Grb2 activado Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico (EGFR) recruta GFP-Grb2 para a membrana do plasma sobre a expressão de ADNc e, subsequentemente, deslocar-se para os compartimentos endossomais na célula. A fim de identificar em complexos de proteínas in vivo de Grb2, esta técnica pode ser usada para executar uma genome-wide screen de alto conteúdo com base em mudanças na Grb2 localização sub-celular. A preparação de clones de expressão de cDNA, de transfecção e de aquisição de imagem são descritos em detalhe abaixo. Em comparação com outros métodos genómicas utilizadas para identificar parceiros de interacção de proteínas, tais como levedura e dois hybrid, esta técnica permite a visualização dos complexos de proteínas em células de mamífero no local sub-celular de interacção através de um ensaio com base em microscopia simples. Por isso as duas características qualitativas, como padrões de localização pode ser avaliada, bem como a resistência quantitativa da interacção.

Protocolo

1. Escolhendo clones de expressão de cDNA

1. A biblioteca de ADNc é proporcionado como único clones bacterianos em estoques de glicerol num formato de 96 poços. Usando o comando rearray no menu do seletor do CP7200 Norgen, escolher clones de bactérias da placa de fonte e inocular em 1,5 ml LB / amp em um 96-deepwell (1 ml bem) prato.
2. Selar as placas Deepwell com uma vedação estanque ao gás-permeáveis ​​e incubar durante a noite a 37 ° C num agitador.

2. Preparação de biblioteca de expressão de cDNA

1. Rodar as placas Deepwell contendo as bactérias a 2.000 rpm durante 20 minutos utilizando adaptadores de placa, numa centrífuga de topo de mesa.
2. Aspirar media dos poços, deixando intacto o sedimento bacteriano.
3. Configurar o pavimento da estação de trabalho de automatização do laboratório, como mostrado na Figura 2. As soluções para a preparação de plasmídeo são distribuídos em calhas 1-5 e a placa deepwell é colocado no convés. A calha de múltiplas cavidades com uma solução de eluiçãoé colocado adjacente à placa deepwell. Dicas são carregados para as prateleiras da ponta.
4. Montar o distribuidor de vácuo. A placa de ligação do plasmídeo é colocado dentro do tubo de distribuição e a placa de filtro de plasmídeo é colocado no topo do colector.
5. Ressuspender pelotas com 250 ul Solução 1 (tampão de ressuspensão) pipetando para cima e para baixo.
6. Lisar as bactérias, por adição de 250 ul de solução de 2 (tampão de lise). A placa é selada e invertido para permitir a mistura completa.
7. Iniciar temporizador 2 min.
8. Adicionar 350 ul de solução de 3 (tampão de neutralização). Selar a placa e inverta 3 vezes.
9. Transfira os lisados ​​bacterianos para as placas de filtro de plasmídeos.
10. Aplicar vácuo durante 5 minutos.
11. Remova a placa do filtro e colocar a placa de ligação na parte superior do colector. Aplicar vácuo durante 1 min.
12. Adicionar 500 ul de lavagem adicional (AW) buffer.
13. Aplicar vácuo durante 2 min.
14. Adicionar 900 uL de solução tampão de lavagem 4. Aplicar vácuo durante 2 min.
15. Repita step 2,14. Aplicar vácuo durante mais 15 min.
16. Coloque placa ADN coleção dentro do coletor. Adicionar 100 ul de tampão de eluição para a placa de ligação e incubados durante 2 min.
17. Vácuo durante 10 min.
18. Retire a placa de recolha e concentração de DNA medida usando o 8000 Nanodrop. Tipicamente um rendimento de ~ 100 ng / uL pode ser esperado com este método.

3. Sementeira celular

1. As células HEK293 foram tratadas com tripsina e contadas.
2. 2 x 10 ⁴ células são distribuídas em cada poço de uma Viewplate PerkinElmer usando o ThermoFisher 96 poços multidrop.
3. As células são incubadas durante a noite a 37 ° C e 5% CO _2.

4. Transfecção

1. Prepara-se uma mistura de 100 ng de DNA plasmídico GFP-Grb2 com 100 ng de cDNA em 25 meio sem soro ul por poço de fundo redondo de uma placa de 96 poços.
2. Adicionar 25 ul de meio isento de soro contendo 0,5 Transfectin uL por poço.
3. Misture e iniciar o temporizador for 30 min.
4. Transferir 50 uL de ADNc / Transfectin mistura para as células usando um método de distribuição suave. Alternativamente, a mistura de transfecção pode ser dispensada primeiro em placas e, em seguida, as células adicionadas no topo (transfecção reversa).
5. Incubar as células durante a noite a 37 ° C e 5% CO _2.

5. Aquisição de Imagem

1. Inicie o software Opera. Um instantâneo da tela da configuração da experiência é mostrado na Figura 3. Selecione a opção "Configuração" e selecione 20x objetivo eo tipo de placa correta. Garantir a "colar" está definido para o valor correto no objetivo de permitir a focagem com tipos de chapas diferentes.
2. Selecione a opção "Microscópio" guia. Definir uma exposição como FITC (488 laser) e exposição de 2 como de UV (365 laser). Ativar o filtro UV em ambas as exposições e atribuir a exposição de 1 a 1 câmera e exposição de 2 a câmera de 2. Definir os tempos de exposição a 800 mseg de exposição 1 e 40 ms para exposição 2.
3. Selecione a opção "Microscópio" guia. Definir eXposure 1 como FITC (488 laser) e exposição de 2 como de UV (365 laser). Ativar o filtro UV em ambas as exposições e atribuir a exposição de 1 a 1 câmera e exposição de 2 a câmera de 2. Definir os tempos de exposição a 800 mseg de exposição 1 e 40 ms para exposição 2.
4. Selecione uma exposição. Definir o foco altura para 0 ^ m. Selecione "Focus". Uma vez focado, expor câmera 1. Ajuste a altura de foco para otimizar o plano de exposição e clique em "altura Take". Alterar os tempos de exposição e potência do laser para dar uma intensidade máxima de pixels de ~ 3.000. Salve parâmetros de exposição. Repita o procedimento para a exposição 2.
5. Selecione "Experimento Definição" guia. Criar layout e sublayout. Arraste e solte o relevante layout, exposição, referência de imagem de arquivo skewcrop, e sublayout. Salve experimento.
6. Selecione "Automatic Experiment" guia e adquirir imagens.

6. Análise de Imagem (Baseado em ImageJ versão 1.46h.)

1. Converter a PerkinElmer proprietário. Arquivos flex para formato TIF. Tif usando oFlex2Volocity roteiro Acapella.
2. 1. Importar imagens em ImageJ como uma sequência de imagens, o que resulta em uma pilha.
   2. Converter a pilha em um canal de 2 hyperstack selecionando a imagem / Hyperstack / Pilha para Hyperstack item de menu. O número de fatias deve ser definido como a metade da pilha importado.
   3. Duplicar o canal GFP usando a imagem / comando Duplicar: assinalar a opção Duplicate hyperstack e especificar Canais: 1-1. A partir de agora usar a pilha duplicado.
3. Selecione Processo / melhorar o contraste com 0,01% de pixels saturados, usando histograma pilha e converter para 8 bits com Image/Type/8-bit.
4. Definir um raio de 15 pixels segmentação locais adaptativo usando o algoritmo Bernsen com limiar de contraste (parâmetro 1) q = 30. Marque os objetos brancos na caixa fundo preto no menu Limiar da Imagem / Ajuste Auto / Local.
5. Controle de qualidade de Segmentação: gerar sobreposição de contorno segmentado objeto nas imagens originais.
6. Feature extração por meio da análise de partículas: área de medição, a média ea intensidade total de cada organela. Salve arquivos de resultado.
7. Abra o arquivo de recursos resultam em R e gerar um histograma.

7. Resultados representativos

Sob condições normais de Grb2 está localizada ao longo da célula inteira. Após a estimulação de um receptor do factor de crescimento, transloca-se para a membrana de plasma e é subsequentemente internalizados em endossomas, como mostrado na Figura 4. A expressão de um receptor na superfície da célula capazes de Grb2 de ligação é suficiente para induzir este translocação. Em uma experiência típica de triagem, nenhuma mudança na GFP-Grb2 localização é observado. No entanto, quando a proteína é expressa, que recruta Grb2 para um local sub-celular, existe uma mudança de localização, que podem ser facilmente visualizadas por microscopia de fluorescência. Para a expressão exemplo, os resultados de EGFR em relocalização da GFP-Grb2 para endossoma estruturas semelhantes (Figura4). Assim, quando a aplicação de uma biblioteca do genoma, pode-se esperar que as novas proteínas de ligação Grb2 de superfície celular podem ser identificadas.

Este método não é limitado à detecção de proteínas da superfície celular. Por exemplo, Dynamin2 induz uma mudança na localização sub-celular de GFP-Grb2 exibindo endossoma-como o recrutamento (Figura 5). Dynamin2 se liga ao domínio SH3 C-terminal de Grb2 e está envolvida na endocitose de ^9,10 neste complexo. Assim, esta abordagem permite a identificação de complexos de proteína de ligação geral e não se limita à identificação de parceiros de interacção para o domínio SH2.

Vários tipos diferentes de translocação pode ser esperado como localização para a membrana plasmática, a endossomas, outras estruturas vesiculares citoplasmáticos ou para o núcleo. Portanto, recomenda-se que todas as imagens são também inspeccionados visualmente. No entanto, quando o rastreio de grandes conjuntos de cDNAs automatizadoalgoritmo de análise de imagem é mais prático. Neste caso, uma combinação de algoritmos é desejável, tais como detecção de ponto para identificar endossomas citoplasma / núcleo de detecção para identificar nucleares de vaivém e os algoritmos morfológicos geral para identificar alterações de forma celular. A utilização destes métodos de detecção diferentes fenotípicas tem sido discutida em mais pormenor noutro local ^11.

Figura 1. Esquema geral da experiência. O experimento detalhes de um fluxo de trabalho de triagem completa de alto teor de partida com a amplificação e preparação da biblioteca de cDNA, a transfecção dos vectores de ADNc de mais construções repórter, aquisição de imagem e análise de imagem utilizando o software ImageJ livre aberto.

Figura 2 Configuração. Tecan do Baralho. (1) No lado da mão esquerda, de cinco calhas de 100 ml de ser cheio com um tampão (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) e A4 (100 ml). A4 calha terá de ser re-enchido uma vez durante o processo. (2) O tubo de vácuo está localizado na posição 14, neste exemplo. (3) A placa deepwell com peletes bacterianas está localizado na posição 30, ao lado da calha de tampão de eluição com 25 ml de tampão de eluição. (4) dicas descartável para a cabeça de 8 canais precisam ser carregados nos suportes de ponta no lado esquerdo e dicas para a cabeça multicanal precisam ser preenchidos na posição 40. A Tecan manipulador líquido FreedomEvo que é usado neste experimento é equipado com 500 seringas uL. Clique aqui para ver maior figura .

Figura3. Automação de aquisição de imagem na LX Opera. A) Selecione a guia Configuração (1). Activar as linhas de laser necessários para a experiência (2). Selecione as câmeras para aquisição de imagem (3). Seleccione o tipo de placa e a lente objectiva para a experiência (4). B) Selecione a guia microscópio (1). Definir a fonte de luz e do tempo de exposição para a exposição de 1 (2,3). Concentre-se em um bem e ter altura (4). C) Selecione a guia Definição Experiment (1). Arraste e solte exposição, skewcrop, layout de referência, e os arquivos sublayout (2). Arraste e solte o arquivo de experiência (3). D) Selecione Experimento automática (1). Arraste e solte arquivos experimento (2). Alocar código de barras apropriado (3). Comece a aquisição da imagem, clicando no botão Iniciar (4). Clique aqui para ver maior figura .

Figura 4. translocação GFP-Grb2 por expressão de cDNA. GFP-Grb2 desloca a partir de uma localização predominante citoplasmática para endossoma estruturas semelhantes sobre a superexpressão de um receptor do factor de crescimento e subsequentemente transmembranar internaliza de endossomas. À esquerda, imagens de microscopia de COS M6 células são mostrados que foram transitoriamente transfectadas com GFP-Grb2 (em cima) ou GFP-Grb2 mais EGFR (em baixo). A co-expressão do EGFR, os resultados de transferência de GFP-Grb2 para endossoma estruturas semelhantes.

Figura 5. Exemplo de cDNA induzido por translocação de GFP-Grb2. O Dynamin2 GTPase, que está envolvida na endocitose mediada Grb2, recoloca-GFP para Grb2 endossoma estruturas semelhantes (círculo). Neste experimento, o GFP-Grb2 foi co-transfectado com DNM2 em células HEK293T. As células foram coradas com Hoechst 33342 após 24 horas e as imagens foram obtidas no Opera LX. Um campo de visão do canal verde (GFP) e a UV (azul; Hoechst 33342) é apresentada.

Discussão

A clonagem de expressão é uma ferramenta poderosa, que tem sido utilizado no passado para identificar novos componentes celulares tais como receptores de vírus e os antigénios de células do sangue ^12. Aqui, nós descrevemos um método para facilitar a identificação de novos receptores de transdução de sinal putativo que se ligam a Grb2.

Existem alguns passos críticos no protocolo.

1. Para a preparação do plasmídeo automatizado é absolutamente essencial ter completa ressuspensão do sedimento bacteriano. Às vezes, é necessário incluir um passo rigorosa agitação ou mistura adicional com pipetas.
2. Após a adição da solução de 2 e 3, a mistura completa é essencial, e temos verificado que manualmente invertendo a placa selada é mais eficiente do que a utilização de um agitador automático. A pipetagem deve ser evitada a esta etapa, uma vez que iria levar a ruptura do ADN.
3. Em todas as etapas de vácuo, tem de se assegurar que o líquido é completamente drenadoa partir da placa. Caso contrário os rendimentos baixos devem ser esperados.
4. Após a eluição, é bastante comum que cai eluato forma na parte inferior da placa de ligação do plasmídeo. Essas gotas devem ser recolhidas na placa de eluição, de modo que é recomendado que a placa de ligação do plasmídeo é levantada com cuidado e as gotas residuais no fundo são cuidadosamente transferido para a placa de eluato.
5. Durante a transf ecção, o tempo de formação do complexo é crítica. Nós geralmente aderem a 20-30 min. Vezes maiores, de até 1 h são bem sem redução no rendimento, enquanto os tempos mais curtos não são recomendados.
6. Para a microscopia, a escolha de ampliação é importante. No sistema LX Opera usada aqui, a resolução a 20x é suficiente para obter imagens de alta qualidade. Se as imagens de alta resolução são necessários, o objetivo pode ser alterado, mas a fim de obter números estatisticamente significativas de células, um maior número de campos e tempos de aquisição mais elevados são necessários. Em geral, procuramosobter pelo menos 100 células fotografada por poço.

O ensaio de translocação Grb2 tem sido utilizado por outros grupos para identificar pequenas moléculas inibidoras de EGFR activação da cinase ^6. Nesse caso, o EGFR é especificamente activada com ligante causando recrutamento de Grb2 à membrana plasmática. Perturbação desta interacção pode então ser investigado utilizando compostos de moléculas pequenas. Do mesmo modo, pode ser previsto que as telas de siRNA podem ser utilizados para identificar genes endógenos envolvidos na sinalização de EGFR-Grb2 ou outros Grb2 de ligação de receptores de factores de crescimento, tais como c-KIT ou o receptor da eritropoietina. Assim, existem várias aplicações potenciais para esta técnica. Uma abordagem semelhante pode ser aplicada a sistemas de GFP-tagged repórter para moléculas adaptadoras, tais como Shc, ou Gab IRS.

Uma das principais vantagens da utilização deste ensaio de células baseado em células de mamífero é que ele permite a identificação de fisiologicamente relinterações vantes. O ensaio é uma leitura para a formação do complexo de proteína, mas mais importante, as interacções relevantes são monitorizados no local sub-celular correcta. A este respeito, esta técnica supera artefactos de outros métodos de interacção proteína-proteína, tais como levedura de dois híbridos ou em ensaios in vitro. Deve notar-se, porém, que as interacções indirectas podem também resultar em recrutamento Grb2. Da mesma forma, a sobre-regulação transcricional dos parceiros de ligação pode ser induzida por expressão de cDNA. Para distinguir entre estas possibilidades, é necessário efectuar os ensaios apropriados secundárias para distinguir entre os efeitos directos e indirectos de ligação.

Em conclusão, o GFP adaptador ensaio translocação molécula promete alto potencial de genoma de triagem e aplicações de descoberta de drogas.

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
biblioteca de cDNA	Origene
LB ampères +
Gás-permeáveis ​​selos	ThermoScientific	AB-0718
Nucleospin Kit 96 Plasmid	Macherey-Nagel	740.625,4
Transfectin	BioRad	170-3351
Hoechst33342	Molecular Probes	H3570
Viewplate 96 F TC	PerkinElmer	6005182
RapidPick	Hudson		Norgren CP7200
Liberdade Evo	Tecan		Com distribuidor de vácuo
384 Multidrop	Thermo
Opera LX	PerkinElmer