RNA-seq Análise de transcriptomas de trombina-tratados e controle humano pulmonar células endoteliais microvasculares

Dilyara Cheranova; Margaret Gibson; Suman Chaudhary; Li Qin Zhang; Daniel P. Heruth; Dmitry N. Grigoryev; Shui Qing Ye

doi:10.3791/4393

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Method Article

RNA-seq Análise de transcriptomas de trombina-tratados e controle humano pulmonar células endoteliais microvasculares

DOI:

10.3791/4393

⸱

February 13th, 2013

Dilyara Cheranova¹, Margaret Gibson¹, Suman Chaudhary¹, Li Qin Zhang¹, Daniel P. Heruth¹, Dmitry N. Grigoryev¹, Shui Qing Ye¹

¹Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

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Resumo

Este protocolo apresenta um procedimento completa e detalhada para aplicar RNA-seq, uma tecnologia de DNA poderoso próxima geração de sequenciação, de transcriptomas de perfil em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares, com ou sem tratamento com trombina. Este protocolo é generalizável a várias células ou tecidos afetados por reagentes ou estados diferentes doenças.

Resumo

A caracterização da expressão do gene em células por meio de medição de níveis de mRNA é uma ferramenta útil na determinação de como a maquinaria transcricional da célula é afectada por sinais externos (por exemplo, tratamento com drogas), ou como células diferem entre um estado saudável e de um estado de doença. Com o advento e aperfeiçoamento contínuo da próxima geração de tecnologias de sequenciação de DNA, RNA-sequenciação (RNA-seq) tornou-se um método cada vez mais popular de análise do transcriptoma para catalogar todas as espécies de transcritos, para determinar a estrutura da transcrição de todos os genes expressos e quantificar os níveis de expressão de mudar o conjunto total de transcritos de ^1,2 um tecido, célula ou organismo determinado. RNA-seq está a substituir gradualmente microarranjos de DNA como um método preferido para a análise do transcriptoma porque tem as vantagens de um perfil transcriptoma completa, proporcionando um dado tipo digital (número de cópias de qualquer transcrição) e não se basear em qualquer sequen genómico conhecidoce ^3.

Aqui, apresentamos um protocolo completo e detalhado para aplicar RNA-seq para transcriptomas perfil em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares com ou sem tratamento de trombina. Este protocolo é baseado em nosso estudo recente publicado intitulado "RNA-seq revela Transcriptoma Novel de genes e suas isoformas em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares Tratados com trombina," ⁴ em que realizaram com sucesso a primeira análise completa do transcriptoma humano pulmonares células endoteliais microvasculares tratado com trombina usando RNA-seq. Ele rendeu recursos sem precedentes para a experimentação ainda mais para obter insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes trombina mediada disfunção endotelial na patogênese de doenças inflamatórias, câncer, diabetes e doença cardíaca coronária, e fornece novas pistas para potenciais alvos terapêuticos para essas doenças.

O texto descritivo deste protocoloé dividido em quatro partes. A primeira parte descreve o tratamento de humanos pulmonares células endoteliais microvasculares com trombina e isolamento de ARN, análise de qualidade e de quantificação. A segunda parte descreve a construção da biblioteca e seqüenciamento. A terceira parte descreve a análise de dados. A quarta parte descreve um ensaio de RT-PCR de validação. Os resultados representativos de vários passos-chave são exibidos. Dicas úteis ou precauções para impulsionar o sucesso em passos-chave são fornecidos na seção de Discussão. Embora este protocolo utiliza humanas pulmonares células endoteliais microvasculares tratados com trombina, pode ser generalizado para transcriptomas perfil em ambas as células de mamíferos e não mamíferos e dos tecidos tratados com diferentes estímulos ou inibidores, ou para comparar transcriptomas em células ou tecidos entre um estado saudável e um estado de doença.

Protocolo

Um fluxograma descrevendo este protocolo é mostrado na Figura 1.

1. O tratamento de células com trombina, RNA Isolation, Quality Assessment e Quantificação de RNA

Cultura As células endoteliais microvasculares de pulmão humano (HMVEC-LBL) a 90-100% de confluência em placas de 6 poços em meio EGM-2 com 5% de FBS, factores de crescimento e antibióticos (Lonza, cat # CC-3202).
Alterar media para os meios de comunicação de fome (0% de FBS) 30 min antes do tratamento com trombina.
Tratar as células com 0,05 U / ml de trombina ou deixar sem tratamento como um controlo durante 6 horas a 37 ° C e 5% CO _2.
Isolar o RNA total a partir das células tratadas e de controlo, usando o Ambion mir Vana kit de acordo com as instruções do fabricante.
Avaliar a qualidade do RNA com uma Eukaryotic StdSense Experion chip de RNA de acordo com o protocolo padrão na Estação Electrophoresis Experion (Automated= "_blank"> Www.bio-rad.com).
Quantificar o ARN utilizando um método padrão espectrofotométrico.

2. Construção de biblioteca e Sequenciamento

Use de 1 ug de ARN total de elevada qualidade por exemplo como material de partida.
Para construir a biblioteca, seguir o procedimento padrão da Illumina (protocolo n º 15008136 Rev. A). Neste protocolo, duas rodadas de poli (A) de ARNm contendo selecções são realizadas para remover rRNA para minimizar a sequenciação de rRNA.
Avaliar a qualidade das bibliotecas utilizando um chip de ADN Experion 1K de acordo com o protocolo padrão na Estação Electrophoresis Experion automatizada ( www.bio-rad.com ).
Quantificar a biblioteca utilizando qPCR: Usar uma biblioteca que tenha sido previamente sequenciados como uma curva padrão e iniciadores específicos para os adaptadores ligados. Utilizar uma gama de diluições das bibliotecas desconhecidas (por exemplo, 1:100, 1:500 e 1:1000). Execute o acco qPCRrding com o protocolo MM SyberGreen e calcular a concentração original de estoque de cada biblioteca.
Diluir os stocks de biblioteca de 10 nM e armazenar a -20 ° C até estar pronto para agrupar uma célula de fluxo.
Quando estiver pronto para agrupar uma célula de fluxo, descongelar a placa reagente CBOT num banho de água. CBOT é um instrumento utilizado Illumina para agilizar o processo de geração de cluster.
Lavar o instrumento CBOT.
Desnaturar as bibliotecas: Combinar 13 ul de 1x TE e 6 uM biblioteca ul 10 e, para o lado do tubo, adicionar 1 ml de NaOH 1 N (fornecido pela Illumina). Vortex, girada para baixo, incubar à temperatura ambiente durante 5 min e colocar as bibliotecas desnaturados em gelo.
Diluir as bibliotecas: Diluir as bibliotecas desnaturados com pré-gelada de tampão de hibridação (HT1, fornecido pela Illumina) através da combinação de 996 ul HT1 e 4 uL biblioteca desnaturado para uma concentração final de 12 pM. Coloque as bibliotecas desnaturados e diluído em gelo.
Inverter cada fila de tubos da placa CBOT,assegurar que todos os reagentes são descongeladas. Girar a placa, remover / punção os selos tiras e coloque sobre a CBOT.
Ul alíquota 120 das bibliotecas diluídas, desnaturados para um tubo de tira, rotulado 1-8. Adicionar 1,2 uL diluído, biblioteca de controle PhiX desnaturado (de Illumina) em cada tubo como uma espiga de controle. Vortex e girar os tubos e carregá-los na CBOT na orientação correta (tubo n º 1 para a direita).
Carregar uma célula de fluxo e colector para a CBOT.
Completar o fluxo de verificar e começar a corrida de agrupamento.
Após a corrida é completa, veja a entrega de reagente em todas as pistas. Tome nota de quaisquer anormalidades. Quer iniciar a execução de sequenciação imediatamente ou armazenar a célula de fluxo no tubo desde a 4 ° C.
Descongele o seqüenciamento por síntese (SBS, Illumina) reagentes.
Coloque os reagentes para os pontos apropriados nas bandejas de reagentes, tomando cuidado para não tocar os outros reagentes depois de tocar o mix de clivagem.
Usando um nãon-seqüenciamento célula de fluxo (isto é, que foi sequenciado anteriormente), principais linhas de reagente duas vezes.
Limpar completamente a célula de fluxo de sequenciação com EtOH a 70% e Kimwipes, seguido de EtOH a 70% e de papel de lente. Inspecione a célula de fluxo para qualquer fiapo. Re-limpá-lo, se necessário.
Carregar a célula de fluxo para o sequenciador e executar um fluxo de verificação para assegurar que a vedação entre os tubos de distribuição e a célula de fluxo é apertado.
Iniciar a execução seqüenciamento.
Avaliar as métricas de qualidade (por exemplo, a densidade de cluster, clusters de passar filtro, Q30, intensidade), como eles se tornam disponíveis durante a corrida.
Monitorar a intensidade em toda a corrida.
Após 101 ciclos são concluídos, realizar a química de retorno para completar a segunda leitura: Descongelar os reagentes finais emparelhadas e o buffer de Incorporação segunda leitura (ICB, um componente do SBS reagentes, Illumina) e carregar os reagentes.
Continuar a corrida seqüenciamento, avaliando 2 ^ª leitura intensidade, um Q30nd outras métricas de qualidade como os avanços de execução.

3. Análise de Dados

Use a versão mais recente do casava (Illumina, atualmente 1.8.2) para converter os arquivos de base de chamada (. Bcl) arquivos em arquivos. Fastq, estabelecendo fastq-cluster contagem a 0 para garantir a criação de um arquivo fastq único para cada amostra . Descompactar os arquivos fastq para análise a jusante.
Realizar o alinhamento final emparelhado utilizando as mais recentes versões do TopHat (1.4.1) ^5, que alinha RNA-seq lê para mamíferos de tamanho genomas usando o ultra high-throughput alinhador de leitura curta (Bowtie, 0.12.7) ⁶ e SAMtools (0,1. 17) ^7. SAMtools implementa vários utilitários para pós-processamento de alinhamentos no formato SAM. O transcriptoma de referência humano pode ser baixado do iGenomes ( www.illumina.com ). Na corrida TopHat, usamos todas as configurações padrão de parâmetros, incluindo a opção de tipo de biblioteca como fr-unstranded (padrão).
Nosção a CuffDiff programa, uma parte dos botões de punho (1.3.0) ⁸ pacote de software, comparar as células tratadas com trombina para as células de controlo de filtrar os transcritos de genes expressos diferencialmente na antiga com base na referência do transcriptoma humano. Esta comparação detectar a expressão diferencial de transcritos conhecidos. Use o Microsoft Excel para visualizar o resultado em forma de tabela. Na execução do programa Abotoaduras, usamos todos os parâmetros predefinidos. Essas transcrições de genes com FPKM <0,05 e p> 0,05 são filtrados.
Para detectar novas isoformas, executar Cufflinks sem transcriptoma de referência. Comparar os arquivos de transcritos de amostras de referência, utilizando o genoma Cuffcompare e testar a expressão diferencial com Cuffdiff usando os arquivos de transcrição combinados trombina como o genoma de referência para uma análise e os ficheiros de controlo de transcrição combinados, como no genoma de referência para uma segunda análise. Use o Microsoft Excel para visualizar o resultado em formato tabular. Novamente, thostranscrições de e genes com FPKM <0,05 e p> 0,05 são filtrados. Após esta etapa, os pesquisadores podem optar por carregar uma lista de transcrições de notificação recente para o site UCSC Genome Browser ( http://genome.ucsc.edu/ ) para verificar a sua validade por uma inspeção manual.
Apresentar listas de genes diferencialmente expressos para Análise Ingenuity Pathway (IPA, www.ingenuity.com ) para a caracterização dos genes e as vias afetadas pelo tratamento trombina. Nesta etapa, os pesquisadores podem optar por usar cummerbund ( http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), um pacote de R que é projetado para ajudar e simplificar a tarefa de analisar Cufflinks saída de RNA-seq, para ajudar a gerenciar, visualizar e integrar todos os dados produzidos por uma análise Cuffdiff.

4. Validação dos resultados RNA-seq por quantitativa em tempo real-PoReacção lymerase Chain (qRT-PCR)

Realizar isolamento de RNA total do controle e da trombina tratados HMVEC Lbl células, RNA qualidade de avaliação e quantificação de RNA descrito nos Passos 1,4-1,6.
Gerar DNA complementar a partir de 1 ug de RNA total de cada amostra com o Superscript First-Strand III Síntese Kits sistema RT, seguindo as instruções do fabricante (Invitrogen, 18080-051).
Executar qRT-PCR em uma VIIa Applied Biosystems 7 Real-Time PCR System usando Taqman Assay-on-Demand oligonucleótidos concebidos para a detecção de CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -associated factor 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) e β-actina (ACTB, Hs99999903_m1). Cada amostra tinha um modelo equivalente a 5 ng de RNA total. Medir a quantificação utilizando o método DDCT e normalizar a β-actina. Cada ensaio foi realizado através de, pelo menos, três repetições biológica.