<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; Ó</sub&gt; ATPase Vesicle Preparação e Técnica para Execução de Remendo Recordings Grampo de membranas de vesículas submitocondriais

Resumo

Um método para isolar vesículas submitocondriais enriquecidas em F1FO ATP sintase a partir de complexos de cérebro de rato é descrito. Essas vesículas permite o estudo da actividade de F1FO complexo ATPase ea sua modulação por meio da técnica de gravação de patch clamp.

Resumo

As mitocôndrias são envolvidos em várias funções celulares importantes incluindo o metabolismo, ^uma sobrevivência, desenvolvimento e, a sinalização de cálcio ^2. Duas das mais importantes funções mitocondriais estão relacionadas com a produção eficiente de ATP, a moeda de energia da célula, pela fosforilação oxidativa, e na mediação de sinais para a morte programada das células ^3.

A enzima primariamente responsável pela produção de ATP é a F1FO-ATP sintase, também chamada ATP sintase ^4-5. Nos últimos anos, o papel da mitocôndria na morte celular por apoptose e necrose tem recebido uma atenção considerável. Na morte celular por apoptose, Bcl-2, tais como as proteínas da família Bax entrar na membrana mitocondrial externa, e oligomerizar permeabilizar a membrana externa, libertando factores pró-apoptóticos para o citosol ^6. Na morte celular necrótica clássico, tal como a produzida por isquemia ou excitotoxicidade em neurónios, um large, aumento pouco regulada em matriz de cálcio contribui para a abertura de um poro da membrana interior, a poro de transição da permeabilidade mitocondrial ou PTPm. Este despolariza a membrana interna e provoca deslocamentos osmóticos, contribuindo para a ruptura da membrana externa, a libertação de factores pró-apoptóticos e disfunção metabólica. Muitas proteínas, incluindo Bcl-xL ⁷ interagir com F1FO ATP sintase, modulando a sua função. Bcl-xL, interage directamente com a subunidade beta da sintase ATP F1FO, e esta interacção diminui uma condutância de vazamento dentro do F1FOATPasecomplex, aumentando a rede de transporte de H + por F1FO durante F1FO ATPase ⁸ e aumentando assim a eficiência mitocondrial. Para o estudo da atividade e modulação da ATP sintase, que isolado do cérebro de roedores submitocondriais vesículas (SMVs) contendo F1FO ATPase. Os SMVs manter a integridade estrutural e funcional do F1FO ATPase como mostrado na Alavian et ai. Aqui, nós descrevemos um métodoque temos utilizado com sucesso no isolamento de SMVs de cérebro de rato e delinear a técnica de patch clamp para analisar a actividade de canal (ião vazamento condutância) dos SMVs.

Protocolo

1. Cérebro mitocondrial Isolation (Adaptado de Brown MR et al. ⁹⁾

1. Sacrificar o rato usando métodos aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).
2. Corte a cabeça do animal por decapitação, cortar a pele e expor o crânio.
3. Abra o crânio delicadamente cortando com uma tesoura ou rongeur. Remover o cérebro.
4. Picar finamente o cérebro sem cerebelo em tampão de isolamento (ver Tabela 1) e transferi-lo para a 5 ml de vidro / teflon homogeneizador (veja lista de equipamentos).
5. Homogeneizar o tecido suavemente 10 vezes (sem bolhas), cerca de 5 min.
6. Centrifugar amostra a 1500 × g durante 10 min a 4 ° C numa centrífuga de bancada.
7. Salve o sobrenadante (mitocondrial e sinaptossomas) e descartar o pellet (material nuclear e de restos celulares). Centrifugar a 16.000 × g durante 10 min a 4 ° C numa centrífuga de bancada.
8. Descartarsobrenadante e re-suspensão da pelota em 500 ul de tampão de isolamento. Disrupt sinaptosomas com uma embarcação rompimento celular (veja lista de equipamentos). Aplicar uma pressão de 1200 psi, durante 10 min, seguido por descompressão rápida.
9. Camada a mistura em gradientes de Ficoll (ver Tabela 2), em lugar do rotor SW-50.1 e centrifugar a 126.500 x g durante 20 min a 4 ° C numa ultracentrifugadora (ver lista de equipamento). O sedimento é purificado a mitocôndria, a camada entre as diferentes densidades de Ficoll sinaptossomas é ininterrupto.
10. Lavar pelete por centrifugação em tampão de isolamento a 16.000 × g durante 10 min a 4 ° C numa centrífuga de bancada.

2. Submitocondriais vesículas (SMV) Isolamento (Adaptado de Chan et al. ¹⁰⁾

1. Re-suspender as mitocôndrias em 200 ul de tampão de isolamento combinada com um volume igual de 1% de digitonina e permitir a sentar-se em gelo durante 15 min.
2. Adicionar mais isolamento Buffer e centrifugar a 16000 x g durante 10 min a 4 ° C numa centrífuga de bancada. Faça isso duas vezes.
3. Re-suspender o pellet em 200 mL tampão de isolamento e adicionar 2 mL de 10% Lubrol PX (C12E9). Misture e permitir a sentar-se no gelo durante 15 min.
4. Camada de mistura em tampão de isolamento, no lugar do rotor SW-50.1 e centrifugar a 182.000 x g a 4 ° C durante 1 hora.
5. Lavagem final dos aglomerados por centrifugação numa centrífuga de mesa superior em tampão de isolamento a 16.000 × g durante 10 min a 4 ° C.

3. A gravação eletrofisiológico

1. Um equipamento típico electrofisiologia inclui um amplificador, um computador PC 1440A equipado com um interface de conversor de analógico para digital Digidata em conjunto com o software pClamp10.0, manipuladores, um microscópio, uma mesa de isolamento de vibrações, gaiola de Faraday.
2. Tubos capilares de vidro de borosilicato são inseridos em um Flaming / Brown Micropipeta Puller modelo P-87. Um programa de pipeta-extrator é otimizado paragerar pipetas com resistências entre 80 a 100 mohms.
3. SMVs são colocadas numa solução fisiológica intracelular (ATP é adicionado no momento apropriado, durante a gravação) (Tabela 3). Patch clamp pipetas são cheias com a mesma solução (sem ATP). As gravações são feitas através da formação de um selo giga-ohm para SMVs à temperatura ambiente. As vesículas são visualizadas por microscopia de contraste de fase com um microscópio invertido Nikon ou Zeiss.
4. O potencial de membrana é mantida a tensões que variam de -100 mV a +100 mV, por períodos de 10 segundos. As gravações são filtradas em 5 kHz utilizando os circuitos de amplificador. Nível de ruído elétrico ou não-específico de rua de menos de 1 pA são desejáveis ​​para a gravação bem sucedida.
5. Os dados são analisados ​​com o software Clampfit 10.0, por exemplo, para determinar a frequência e amplitude de eventos de canal único. Dependência de tensão é determinado traçando uma relação de tensão atual.

Resultados

O primeiro passo do nosso protocolo permite o isolamento de mitocôndrias purificadas como mostrado por Western blot na figura 1. Na Figura 2 é mostrado um exemplo de uma gravação de remendo vesícula submitocondriais derivado do cérebro. Usando a configuração de patch de dentro para fora, demonstramos a atividade do canal modulado pela ATP. O controle (CTL) de gravação (esquerda) mostra a atividade multi-canal de condutância com uma condutância pico de 600 pS em média. que f...

Discussão

Os métodos aqui descritos permitem o isolamento de mitocôndrias puro no fim da etapa 1 e vesículas (submitocondriais SMVs) após a etapa 2 a partir de cérebro inteiro sem distinção de célula phenotypes.SMVspurified por este método são essencialmente isentos de contaminação por outros organelos subcelulares, como mostrado na A Figura 1 e o nosso trabalho anterior (Alavian KN et al. ⁸⁾ e mantêm a sua integridade estrutural e funcional antes da congelação. Após congelaç?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle	Krackeler Scientific, Inc.	1-7725T-5
Eppendorf Centrifuge 5424	Eppendorf	5424 000.410
4639 Cell Disruption Vessel	Parr Instrument Company	4639
Ficoll	Sigma-Aldrich	F5415
Polycarbonate centrifuge tubes	Beckman Coulter	P20314
SW-50.1 rotor	Beckman Coulter
L8-70M Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
Lubrol PX (C12E9)	Calbiochem	205534
Axopatch 200B	Axon Instruments
Digidata 1440A	Molecular Device
pClamp10.0	Molecular Device
Manipulator	Sutter Instrument
Borosilicate glass capillary	World Precision Instruments	1308325
Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87	Sutter Instrument