Citometria de massa: Protocolo para Ajuste Diário e amostras de células em execução em um citômetro de Massa CyTOF

Resumo

Os passos necessários para a sintonização diária e optimização do desempenho de um citómetro de massa CyTOF são descritos. Comentários sobre a preparação da amostra ideal e vazão são discutidos

Resumo

Nos últimos anos, a análise rápida de células individuais tem sido normalmente realizadas utilizando a citometria de fluxo por fluorescência e anticorpos marcados. No entanto, a questão da sobreposição espectral de emissões fluoróforo tem limitado o número de sondas simultâneas. Em contraste, o citómetro de nova massa CyTOF por casais DVS Sciences um sistema de introdução de líquido de uma única célula de um ICP-MS. ^Uma vez de fluoróforos, os polímeros de quelação que contenham os isótopos de metal altamente enriquecidas são acopladas a anticorpos ou outras sondas específicas. ^2-5 Devido à pureza do metal e resolução de massa do citómetro de massa, não existe nenhum "sobreposição espectral" de isótopos vizinhos, e, portanto, não há necessidade de matrizes de compensação. Além disso, devido ao uso de metais lantanídeos, não há biológico e, por conseguinte, qualquer equivalente de autofluorescência. Com uma janela de massa estendida massa atómica 103-203, teoricamente até 100 etiquetas podem ser distinguidos simultaneamente. Atualmente, Mais de 35 canais estão disponíveis usando os reagentes quelante disponível a partir de DVS Sciences, permitindo a dissecção sem precedentes do perfil imunológico de amostras. ^6-7

Desvantagens para citometria de massa incluem o requisito estrito para um isótopo de metal separado por sonda (nenhum equivalente de dispersão frontal ou lateral), e o facto de que é uma técnica destrutiva (sem possibilidade de separação de recuperação). A actual configuração do citómetro de massa também tem uma taxa de transmissão de células de apenas ~ 25%, o que requer um maior número de células de entrada.

Desempenho diário ideal do citômetro de massa requer várias etapas. O objectivo básico da optimização é maximizar a intensidade de sinal de medição dos isótopos de metal desejados (M) ao mesmo tempo minimizando a formação de óxidos (M 16), que irá diminuir a intensidade do sinal M e interferir com qualquer sinal desejado em M 16. O primeiro passo é aquecer a máquina para um quente, eu estávelCP plasma foi estabelecida. Segundo, as definições para a taxa atual e make-up de fluxo de gás deve ser otimizada em uma base diária. Durante a recolha de amostra, a taxa máxima de células evento é limitada pela eficiência do detector e a velocidade de processamento de 1000 células / segundo. No entanto, dependendo da qualidade da amostra, uma taxa mais lenta do evento de células (300-500 células / segundo), é usualmente desejável para permitir uma melhor resolução entre os eventos de células e, assim, maximizar singlets intactas sobre doublets e detritos. Por fim, a limpeza adequada da máquina no fim do dia, ajuda a minimizar o sinal de fundo, devido ao metal livre.

Protocolo

Todas as amostras de células para a CyTOF devem ser fixadas e permeabilizadas. Isto permite uma maior entrada do intercalador de ADN contendo irídio, e também evita que a lise das células durante a lavagem com água MilliQ e ressuspensão passos imediatamente antes de proceder à injecção no citómetro de massa.

1. Start-up da Citómetro Massa

1. Abra o programa de software CyTOF. Selecione Configuração do instrumento. Na guia do gabinete, ir para o canto inferior direito e clique aquecedor "ON" botão. Ligar o aquecedor, pelo menos, 15 min antes do momento desejado para permitir tempo suficiente para que o manto da câmara de pulverização para alcançar 200 ° C.
2. Substituir o branco Norm Ject-seringa de 3 ml na bomba de seringa, com uma seringa cheia de água fresca MilliQ.
3. Limpeza nebulizador. Backflush o nebulizador usando a seringa eo tubo de puxar 5% citranox 2-3 vezes por meio da porta tanto menor a introdução de líquidos e a porta de maior introdução de gás. Repita retrolavagem com água MilliQ to Remover citranox residual.
4. Verificar para confirmar que as luzes no painel frontal do CyTOF são iluminadas, como na Figura 1.

Figura 1. CyTOF luzes do painel antes de inicialização.

5. Abra argônio válvula do tanque de gás. Isso deve fazer com que o "ARGON" luz na frente para ligar.
6. Fixe o nebulizador para make-up de entrada de gás. Desaparafuse o make-up conector tubulação de gás e remover o preto de borracha o-ring ea peça cônica de plástico branco. Note-se a maior "junta" na haste porta gás introdução do nebulizador. Coloque o conector na porta de introdução de gás. Colocar o anel em O preto sobre a extremidade da porta de gás, e forçar o o-ring passado a parte mais larga da haste da porta. Coloque a peça cónica de plástico branco na parte superior com a parte mais estreita apontou, e parafuso para a tubulação de gás make-up.
7. Coloque o nebulizador para o tubo de introdução de líquidos. Insira cuidadosamente o tubo pequeno dentro da abertura na extremidade do nebulizador. Haverá duas paradas, semelhantes em sentir as paradas em uma micropipeta. Primeiro, prima até encontrar resistência à luz, a extremidade do tubo deve ser pequeno, no final da secção recta de vidro. Em segundo lugar, pressionar mais difícil de forçar o fim da secção recta de vidro ainda mais no encaixe, e apertar o parafuso de montagem para selar. Inserir a extremidade do nebulizador para a abertura branco no manto de aquecimento.
8. No separador Controlador RFG da janela Configuração do Instrumento, pressione "Start Plasma". Desde o nebulizador já está inserido, pressione "OK". O software irá ligar o chiller, iniciar o fluxo de gás, e inflamar um plasma. A tensão detector irá aumentar. Haverá uma janela pop-up dizendo "Plasma seqüência de inicialização foi concluído com êxito" quando terminar, pressione "OK". Novas luzes deve ser em no painel frontal (Figura 2 >).

Figura 2. Luzes do painel de plasma CyTOF após inflamado e start-up com êxito.

9. Ligar bomba de seringa. No canto superior direito, pressione o verde "play" para iniciar a bomba de seringa e começar a fluir líquido através do tubo e pulverização fora do nebulizador. As configurações de seringa padrão são de 3 ml de água. Para que amostra a fluindo através do loop de amostra, a bomba de seringa devem ser periodicamente alterada quando ele é executado fora de água. Na parte superior do ecrã, existe um contador que indica a quantidade de líquido fluiu para fora da bomba de seringa. A bomba de seringa parará quando o contador atingir "3,000" ou o êmbolo atinge a extremidade da seringa. Ao recarregar a seringa, você deve clicar em "stop" em vez do azul "pausa" botão para reiniciar o contador.

e "> 2 de Calibração. Diário do Citómetro Massa

1. O citômetro de massa vai precisar de aproximadamente 20 minutos para conseguir um plasma quente e estável antes de calibração. O objectivo dos passos de sintonia é maximizar o sinal desejado do Tm169 ou Tb159, mantendo "Gd155" (óxido; La139 + O16) de sinal inferior a 3% do valor mais elevado. Clique na Aquisição botão Configurações para abrir a janela Configurações de Aquisição de Dados. Na guia Parâmetros, clique na tabela periódica para abrir o painel de seleção de isótopo. Selecione os isótopos na solução de ajuste DVS Ciências listados no manual, em seguida, clique em "salvar".
2. Clique nos Isótopos por leitura botão para abrir a Massa (s) por janela de leitura. Selecione "Pulsos Count", e redimensionar o eixo-y, digitando um novo número e pressionar "enter".
3. Encha uma seringa de 1 ml verde Norm-Ject com solução de sintonia. Rode o selector de porta amostra para "carregar", injetar 450 ml de solução de sintonia, ligue o selector para "injetar". Na guia Calibração de Missa do Acquisit Dados íon janela Configurações, pressione "Executar" para monitorar o que as massas estão fluindo por. O lado esquerdo da janela é menor massa, enquanto que o lado direito é mais elevada em massa. Nota: existirão sinais na região de 9400-9800 TOF, devido aos isótopos de xénon no gás árgon (Figura 3). Espere até que os isótopos de soluções de afinação começam a aparecer como faixas neste display (Figura 4).

Figura 3. Missa janela da guia de calibragem, mostrando os níveis de fundo para vários isótopos após a solução de lavagem e enxágüe. A região em torno TOF 9400-9800 corresponde a isótopos de xenônio no gás argônio, e deve estar sempre presente. Clique aqui para ver maior figura .

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Figura 4. Missa janela da guia de calibração, mostrando faixas verticais de vários isótopos em DVS solução tuning. Clique aqui para ver maior figura .

4. Volte para o Massa (s) por leitura janela e pressione o verde botão "Play" no canto superior esquerdo. Cada isótopo seleccionado no passo 2.1 é representada por uma linha de cor diferente. O padrão eixo x é "Time", em seg. Monitorizar os níveis de isótopos diferentes até que eles são estáveis.
5. Sintonia da corrente. Na guia Parâmetros da janela Configurações de Aquisição de Dados, selecione "corrente" no menu drop-down. Vamos começar = 0, acabamento = 10 valor do passo, = 0,5 tempo, estabelecendo-se = 200, e pressione "salvar". Clique novamente no Massa (s) por janela Leitura e jogo da batida. O eixo x é agora "atual". Notar que os sinais de pico de isótopos (Figura 5), e r ECORD. Na guia Configuração do DAC Canais da janela de configuração do instrumento, desça até "atual" e digite o novo valor. Pressione o botão "Definir valor actual", depois em "salvar".

Figura 5. Perfil ajuste atual.

6. Sintonia do gás tornar-se-. Alterar menu drop-down para "gás Make-up". Vamos começar = 0,55 final, = 0,95 valor do passo, = 0,05, tempo de sedimentação = 200. Pressione salvar. Voltar para a Massa (s) por janela Leitura e jogo da batida. O eixo x é agora "Make-up gás" taxa de fluxo. Gravar em que os sinais de pico de isótopos. Observar o rápido aumento da "Gd155" sinal perto do fim (Figura 6). Voltar para a guia Configuração DAC Canais, desça até "gás Make-up", e digite o novo valor. Pressione o botão "Definir valor actual", depois em "salvar".

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Figura 6. Make-up perfil sintonia gás.

7. Proporção de gravação desejado isótopo óxido vs. Faça uma injeção de 450 segundo ml de solução de sintonia. Na guia Parâmetros, selecione "Time" a partir do menu drop-down, vamos começar = 0 end, = 10, valor do passo = 1, tempo de repouso = 200. Pressione o botão "salvar". Hit "play" em Massa (s) por leitura janela. Após as linhas de ter estabilizado (Figura 7), use o cursor para ler o valor nas caixas superior esquerdo para Tm169 ou Tb159 (maior valor) e também o valor "Gd155" (<3% do valor mais elevado). Estes valores também podem ser salvos em um arquivo de ajuste para referência futura.

Figura 7. Medição de intensidades de ajuste de sinal solução após a otimização de gás atual e Make-up.

8. Limpeza de samloop de PLE. Injectar 3 ml de água MilliQ através do laço de amostra, seguido de 500 ul de solução de lavagem DVS. Monitorar o progresso da limpeza pressionando "corrida" na guia Calibração de Massa. Lavar até que a intensidade das estrias (Figura 4) começa a diminuir, siga por 3 ml de água MilliQ e monitor até que a níveis de fundo (Figura 3).

3. Amostras de funcionamento

1. Abrir a janela de aquisição. Configurações padrão: fazer uma análise = On-The-Fly, o sinal para analisar os dados = Dual, calibração de contagem dupla =. Redução de Ruído é selecionado. Qualquer um destes pode ser alterado, se desejado. Digite o nome do arquivo. Todos os arquivos devem ser salvos no :/ E / unidade.
2. Definir atrasos de aquisição. Haverá um ligeiro atraso no registo de eventos celulares de cerca de 30 segundos, devido ao comprimento do tubo entre o circuito de amostra e do nebulizador. Portanto, a soma total de "atraso Aquisição" e "st Detectoratraso capacidade "deve ser de pelo menos de 30 seg. atraso estabilidade Detector deve ser pelo menos de 20 seg.
3. Definir dados de tempo de coleta. "Tempo de aquisição" é o número de segundos que você deseja executar a sua amostra. Enchendo toda a malha 450 ul de amostra seria necessário para completar 600 sec. Sugere-se que 50-100 seg ser adicionado ao fim do tempo de execução para minimizar amostra carry-over.
4. A ressuspensão das amostras. Para minimizar a acumulação de sais na máquina, sugere-se que, pelo menos, duas lavagens em água MilliQ ser feito no final da coloração das células, seguida por uma re-suspensão final em água MilliQ. O volume de água MilliQ utilizado para ressuspender o sedimento de células variará dependendo do número de células que começaram com a recuperação de células e, após o procedimento de coloração inteiro. Um bom ponto de partida é 10 ⁶ (partida) células / ml. Após ressuspensão, filtrar através de um filtro celular para remover agregados.
5. Inicial da amostra executado. Digite um novo nome para a amostra. Mudar a válvula de loop de amostra para "carregar", injectar a amostra, voltar para "injetar", depois clique em "Run" na janela de Aquisição.
6. Registo de eventos celulares. As células serão representados na janela do instantâneo como coleções horizontais de marcas em cada canal isótopo / marcador vertical (Figura 8). Enquanto o citómetro de massa podem registar-1000 células / s, melhor resolução entre os eventos celulares é geralmente obtida a 300-500 células / seg. Isto corresponde a uma média de ~ 1 atualização celular / tela. Pode levar até 30 seg antes do contador de eventos celular começa a subir. Isto é devido ao "On-the-fly" de processamento de dados, sem informações sobre o evento celular é perdido.

Figura 8. Janela Acquisition amostra durante funcionamento, mostrando as linhas horizontais de pontos correspondentes aos elementos associados com três eventos celulares separados.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver maior figura.

7. Qualidade de eventos celulares. Notar qualquer fundo faixas em cada canal de isótopos, bem como a taxa do evento de células. O citómetro de massa reconhece um "evento de células", como um certo aumento no sinal acima do fundo, de modo de sinal de fundo a partir de metal livre ou não ligada do anticorpo pode alterar a "célula" evento de contagem. Além disso, as células funcionando em uma concentração demasiado elevada pode provocar um aumento do número de eventos de gibão. O fundo pode ser diminuída por lavagens adicionais ou de diluição maior de células. Dupletos podem ser minimizados através da diluição maior de células, com o custo de maior tempo de execução.
8. Acabamento de aquisição de dados de amostra. Quando o tempo de aquisição tenha sido alcançado, a recolha de dados irá terminar. Haverá um pouco de atraso antes de uma janela pop-up com um botão "OK" aparece, novamente, isso é devido ao "On-the-fly" processamento de dados. Aquisição da amostra também pode ser parado Prematurely por bater o botão "Stop". Neste caso, todos os eventos celulares já registados serão contados e transformados em arquivos de saída.
9. Injecção de pelo menos 500 ul de água MilliQ entre cada uma das amostras também ajuda a minimizar a mistura de amostras.

4. Limpeza da máquina após o uso

1. Lave solução. Após a amostra final é executado eo loop de amostra lavada com água, injetar 450 ml de solução de lavagem para o loop de amostra. Monitorar o lançamento de metal livre na guia Calibração de Massa da janela Configurações de Aquisição de Dados como no Passo 2,8 (Figura 9). Quando o sinal de metal livre começa a diminuir, lave com 3 ml de água MilliQ e monitorar os níveis de fundo até que sejam alcançados.

Figura 9. Missa janela da guia de calibração, durante o pós-run limpeza com solução DVS Wash. As listras verticais em TOF região 9800-11000 são anticorpos rótulo isótopos sendo limpos para fora da máquina. As estrias verticais ao redor TOF 11.500 correspondem aos dois isótopos intercalador IR. Clique aqui para ver maior figura .

5. Desligar a máquina

1. No separador Controlador RFG da janela Configuração do instrumento, selecione "Stop Plasma". Quando o procedimento estiver concluído, haverá uma janela pop-up pedindo que você retire o nebulizador. Pressione o botão "OK". Na aba do gabinete, desligue o aquecedor. Fechar a válvula da fonte de árgon.
2. A remoção do nebulizador. Remover o nebulizador a partir da câmara de pulverização por puxar cuidadosamente para trás. Desaparafuse o tubo de introdução de amostra de 1,6 passo e colocar de lado. Desaparafuse o make-up de conexão introdução de gás para soltar um pouco, em seguida, puxe o nebulizador fora. Deixando o encaixe aparafusada irá reduzir as chances de losing a borracha preta o-ring e peça cónica de plástico branco.
3. Limpeza nebulizador. Backflush ambas as portas do nebulizador com citranox 5% utilizando a seringa e tubo como no Passo 1.3. Loja, coberto, no citranox 5% até a próxima utilização.

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Resultados

Seguindo o protocolo acima deve realizar quatro coisas. Em primeiro lugar, permitindo que o tempo de aquecimento adequado para o citômetro de massa irá produzir um plasma quente e estável necessário para o sinal ótima e formação de óxido mínimo. Lavagem, segundo adequada do citómetro de massa com MilliQ água e solução de lavagem DVS (Figura 9) vai ajudar a reduzir os níveis de metal de adsorção para a tubagem e outras partes da máquina, ajudando a reduzir o fundo durante a aquisição d...

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Discussão

Para as últimas décadas, a citometria de fluxo de fluorescência tem sido um método laborioso para a análise de células individuais, quer em termos de expressão de superfície e em ensaios funcionais. No entanto, os problemas de sobreposição espectral dos corantes fluorescentes tem limitado o número de marcadores em simultâneo. Embora experimentos com mais de 12 marcadores simultâneos têm sido relatados, o montante da compensação necessária torna esta tecnicamente difícil.

Em...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
CyTOF TM massa citómetro	DVS Ciências
Lave solução	DVS Ciências	201071	0,05% de ácido fluorídrico em água
Ajustando solução	DVS Ciências	201072	0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, traço de ácido nítrico
Ue contêm esferas de poliestireno	DVS Ciências	201073	Contém isótopos naturais abundância UE; contas fornecidos em aproximadamente 1 milhão / mL
Multi-lantanídeos contendo (La / Pr / Tb / TM / Lu) - esferas de poliestireno	DVS Ciências	Ainda não disponível comercialmente	Contém natural abundância de isótopos de lantanídeos listadas
Ácido nítrico (concentrado)	Fisher Scientific	A467-500	Optima-trace metal puro ICP-MS grau
Tubo de fundo redondo de poliestireno com células coador-cap-5ml	BD	352235	usado para filtrar amostras de células antes da injecção
Norm-Ject tuberkulin seringa-1mL	Henke Sass Lobo	4010-200V0	sem silicone, sem látex
Norm-Ject-seringa de 3 mL	Henke Sass Lobo	4010.000V0	sem silicone, sem látex
Água MilliQ			18 MQ água pura, não deve ser armazenado em garrafas de vidro ou de plástico que foram lavados com detergente comercial (devido a seus altos níveis de presente de bário).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	detergente ácido
O gás argônio	Praxair	AR 5.0UH-T	99,999% de pureza ultra-elevada