Estudo quantitativo de locomoção livremente Natação Micro-organismos Usando Difração Laser

Resumo

Organismos microscópicos, como o nematóide de natação livre C. elegans, Viver e se comportar em um ambiente tridimensional complexa. Nós relatamos uma nova abordagem que prevê a análise de C. elegans Usando os padrões de difração. Esta abordagem consiste em acompanhar a periodicidade temporal de padrões de difração gerados por direcionar a luz de laser através de uma cuvete.

Resumo

Solo e organismos microscópicos aquáticos vivem e se comportam em um ambiente tridimensional complexa. A maioria dos estudos de comportamento organismo microscópico, pelo contrário, foram realizados utilizando microscópio abordagens, que limitam o movimento e comportamento de um estreito campo quase bidimensional focal. ^Uma Apresentamos uma nova abordagem analítica que fornece em tempo real A análise de livremente nadar C. elegans num cuvete sem dependência de equipamento microscópio baseada. Esta abordagem consiste em acompanhar a periodicidade temporal de padrões de difração gerados por direcionar a luz de laser através da cuvete. Medimos freqüências de oscilação para os nematóides livremente natação.

Análise dos padrões de difracção de campo distante revela pistas sobre as formas de onda dos nematóides. Difração é o processo de dobragem de luz em torno de um objecto. Neste caso, a luz é difratada pelos organismos. As ondas de luz interferem e podem formar anúncioiffraction padrão. Um campo distante, ou de Fraunhofer, o padrão de difração é formado se a distância tela-objeto é muito maior do que o objeto difração. Neste caso, o padrão de difracção podem ser calculadas (modelada) utilizando uma transformada de Fourier. ^Dois

C. elegans são de vida livre do solo-moradia nematóides que navegam em três dimensões. Eles se movem ambos em uma matriz sólida como o solo ou ágar em um padrão sinusoidal locomotora chamado rastreamento e no líquido em um padrão diferente, chamado de natação. ^Três os papéis desempenhados por informações sensoriais fornecidas pelo mecanosensorial, chemosensory, e as células thermosensory que governam mudanças plásticas em locomotora padrões e interruptores em padrões estão apenas começando a ser elucidado. ⁴ Nós descrevemos uma abordagem óptica para medir a locomoção de nematóides em três dimensões que não requerem um microscópio e vai nos permitir começar a explorar as complexidades de locomoção do nematóide, em co diferentenditions.

Protocolo

1. C. elegans Preparação para Análise de Vídeo

1. Mova 10-20 nemátodos adultos grávidos para placas de agar fresco NGM cheios de Petri, utilizando um fino fio achatado picareta platina. As placas de Petri cheio com o agar NGM conter uma pequena mancha circular de E. coli (estirpe um crescimento limitado, OP50, dá os melhores resultados) para os nematóides para comer. Permitir que os nematóides para colocar ovos de 3-5 horas e, em seguida, remova os adultos, estabelecendo assim uma cultura pequena, developmentally sincronizado de 50-150 nematóides. Permitir que os nemátodos a crescer até à idade adulta precoce, incubando as placas de Petri a 20 ° C durante 4-5 dias. Estes métodos baseiam-se na cultura de procedimentos estabelecidos (Stiernagle 2006) ^5.
2. No dia da análise de vídeo, lavar a placa de nemátodos adultos jovens com 1 ml de água desionizada destilada, recolhendo assim 50-150 vermes da cultura sincronizados. Uma solução tampão M9 ou PBS como também pode ser usado. Use uma microcentrífuga para girar a wORMs para a parte inferior do tubo, ou que permitam a resolver pela força da gravidade para cerca de 15 min. Remover a maior parte da água a partir do tubo e substitui-la com 1 ml de água desionizada destilada, a fim de lavar as bactérias que aderem a partir dos nematóides.
3. Transferir nematóides em água ou tampão para uma cuvette de quartzo utilizando uma micropipeta. É importante trabalhar com um número pequeno, a cerca de 5-10 nemátodes no total de uma só vez ou até mesmo menos, de modo que um nemátodo de cada vez é susceptível de ser iluminada pelo laser. Se o número de nemátodos sobre as placas de cultura é muito grande, os vermes diluir em água ou tampão até uma densidade desejada seja atingida. Também é possível escolher os nemátodos individuais para uma gota de água ou tampão numa placa de ágar fresco para lavá-los e transferir vermes individuais para a cuvete. Em nosso estudo, foram utilizados 1 mm, 2 mm e 5 mm para tamanhos cuvete examinar os efeitos de restrições físicas em nadar comportamento.

2. Configuração ópticos para a Analysi vídeos

1. Faça a configuração como mostra a Figura 1, usando um 543 nm (verde) Hélio-Neon (HeNe) laser, dois espelhos frente da superfície de alumínio, um detentor cuvete, uma tela de projeção, e uma câmera de alta velocidade (Casio High Speed ​​Exilim) capazes de filmar em ~ 240 fps. Os dois espelhos são usados ​​para dirigir o feixe de laser através da cuvete. Os tamanhos diferentes de cuvetes pode ser utilizado, dependendo da natureza do estudo. Como um exemplo, utilizou-se cuvetes que 5 mm de espessura para mostrar os efeitos de limitações espaciais em frequências de natação. O feixe de laser deve satisfazer os requisitos de sobreamostragem,. Isto é, o organismo deve obstruir não mais do que um terço do raio laser. Para C. elegans, o feixe de laser deve ser de cerca de 2 mm de diâmetro quando ele interage com um nemátodo. O feixe de laser não deve ser maior do que 5 mm de diâmetro uma vez que o padrão de di fracção será difícil de localizar. A distância a partir do organismo de difração para a tela deve ser muito maior do queo próprio organismo.
2. Parafilme lugar sobre a parte superior da cuba e inverter para misturar os nemátodos na coluna de água. Coloque a cuvete num suporte de cuvete de modo a que os vermes são inicialmente perto do topo do cadinho. Usando os espelhos, dirigir o feixe de laser através do centro da cuvete. Uma vez que os nemátodes são mais densos do que a água, que vai lentamente cair para o fundo da tina, enquanto que, ao mesmo tempo nadando na coluna de água.
3. Na tela de projecção de cor, a mancha correspondente ao feixe laser transmitido negro para diminuir a dispersão do que o feixe transmitido se encontra com o ecrã de projecção (Figura 2). Alternativamente colocar uma abertura no ecrã de projecção para permitir que o feixe transmitido para passar através da tela. Eliminar ou reduzir a dispersão do feixe transmitido irá manter a matriz CCD da câmara de saturação em função do feixe transmitido.
4. Para capturar uma medida do tamanho do padrão de difracção, desenhar uma linha decerca de 5 cm no ecrã de projecção ao lado do ponto de laser de feixe transmitido, sem interferir com a imagem de luz difractada.
5. Iniciar a gravação com a câmera enquanto a luz do quarto está no modo que a linha de 5 cm é sobre a mesma metragem como as imagens de difração. Desligue a luz da sala. Gravar imagens de difração na tela com a câmera como vermes passam pelo feixe de laser.

3. Preparação de dados de vídeo

1. Instale o programa de vídeo análise (Logger Pro: http://www.vernier.com/products/software/lp/ ) no computador. Importe o vídeo para programa de análise de vídeo
2. Definir a origem de forma a coincidir com o ponto de laser transmitido. Defina a escala usando a linha de 5 cm na tela de projeção.
3. Controlar o deslocamento angular da imagem de difracção formado por cada nemátodo usando o software de análise de vídeo (figura 3)
4. Para encontrar o angular deslocamento tomando o arctan (y / x), copiar e colar dados em uma planilha eletrônica (Excel) e adicionar 180 graus ou π para todos os ângulos negativos para produzir um gráfico contínuo (Figura. 4).

4. Real Time de Aquisição de Dados para a observação instantânea de Frequências Natação

1. Usando a mesma configuração como para a análise de vídeo, coloque um fotodíodo (DET10A de Thorlabs) com uma área pequena (~ 1 mm ²⁾ para fora do centro do padrão de difracção em frente do ecrã de projecção.
2. Conecte o fotodiodo para o osciloscópio digital (PicoScope feito por tecnologia Pico) que se conecta ao computador via porta USB. Observar os padrões thrashing na tela do computador.
3. Salvar conjuntos de dados adquiridos em formato ASCII ou texto.

5. Análise de Dados

1. Importe os dados adquiridos através de vídeo ou o fotodiodo em um programa de análise de dados capaz de encaixe onda qui-quadrado de minimização. O programa usado aqui é Origem ( http://www.originlab.com/ ). Traçar uma curva sinusoidal para determinar a freqüência goleada (Figuras 4 e 5).
2. Média de freqüências de natação de várias amostras e determinar variância. Para este estudo, os dados foram analisados ​​estatisticamente utilizando uma ANOVA factor único seguido pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni. Um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

6. Modelo Padrões de difração usando Mathematica como Exemplo

Nota: os padrões de difração pode ser modelada utilizando diversas ferramentas computacionais. Este procedimento será diferente para diferentes ferramentas computacionais, como MatLab, Excel, origem, etc

1. Criar Imagem: Tire fotos de nematóides em uma lâmina de microscópio utilizando um microscópio tradicional.
2. Binarize imagem: Importar 'Verme' a imagem verme into Mathematica, arrastando a imagem em Mathematica. Converter a imagem em uma imagem em preto e branco (binarize). Isto pode ser conseguido com o 'Binarize' comando em Mathematica: BlackandWhiteImage = Binarize [Worm]. A imagem pode ser vista como uma imagem em preto e branco.
   Como alternativa, use o comando 'EdgeDetect' para criar uma BlackandWhiteImage: EdgeDetect [Worm, 6.0,0.035], onde os dois números finais controlar a aspereza das bordas resultantes.
3. Converter a imagem em uma matriz de zeros e uns: Isso pode ser alcançado com o "ImageData 'comando no Mathematica: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage].
4. Transformada de Fourier matriz: Use o comando "Fourier" em Mathematica para Fourier transformar a matriz usando as FourierParameters indicados: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -> {0, -2}].
5. Módulo quadrado da matriz para obter a matriz de difração e melhorar o contraste da imagem: Praça do absolutovalor da matriz e visualizar a imagem resultante, que é o padrão de difracção correspondente à imagem original. Além disso, usar o 'Log' função para escalar o contraste da imagem: ImageContrast = Imagem [Log [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5].
6. Redimensionar a imagem para facilitar a visualização: Cortar o padrão de difração central e redimensionar como desejado: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500].
7. Comparar os padrões de difração modelados com padrões de difração obtidos de vermes livremente natação. (Figura 6)

Resultados

Como um exemplo, estudamos C. elegans em um quartzo cubeta 1 cm de largura, 5 mm de espessura e 4 cm de altura cuvete. Amostragem de um sem-fim único, utilizando a análise de vídeo, a frequência de natação médio obtido a partir da análise de vídeo numa cuvete de 5 mm de espessura é de cerca de 2,5 Hz (Figura 4). Do mesmo modo, a amostragem de um sem-fim único, utilizando o método de aquisição em tempo real de dados, obtém-se uma frequência de natação de cerca de 2,7 Hz (Figura 5), utilizando o osciloscópio digital (PicoScope). Este procedimento pode ser repetido para muitos vermes. Um estudo detalhado de vermes que nadam livremente revelou uma frequência média de natação de 2,37 Hz a uma cuvette de 5 mm. ^{6 Tal} como esperado, a frequência de natação é maior do que para um verme rastejante (~ 0,8 Hz). ³ Usando este método de difracção, o média freqüências de natação de um C. elegans, que se limita a uma lâmina de microscópio, verificou-se coincidir com o valor publicado anteriormente de 2 Hz. ^1,7

ve_content "> Seguindo procedimentos 3.) e, em seguida, 6.) permite a modelagem de natação padrões de difracção, com a ajuda do sem-fim imagens obtidas com um microscópio convencional. Os padrões de difracção modelados são usados ​​para simular um ciclo de mergulho da C. elegans ( Figura 6). Um modelo de sucesso consiste fisicamente realizáveis ​​padrões nadar sucessivas correspondentes as frequências de natação. O sem-fim deve ser a mesma forma que no final de um ciclo de mergulho como foi no início de um ciclo de mergulho.

Figura 1. Um verde laser HeNe foi usado para criar um padrão de difracção dinâmica usando vivo C. elegans. Este padrão de difração foi filmado a 240 fps.

Figura 2. Dra asa de um ponto preto aumenta a absorção do feixe transmitido. Saturação da câmara devido a luz dispersa é reduzida e o padrão de difracção se torna visível.

Figura 3. Captura de tela do software de análise de vídeo (Logger Pro), com um padrão de difração worm que está sendo monitorado. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 4. Os dados de vídeo que correspondem ao ciclo de mergulho de um nemátodo numa cuvete de 5 mm. O ajuste da curva revela uma frequência de natação Hz ~ 2,5.

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Figura 5. Dados em tempo real que correspondem ao ciclo de mergulho de um nemátodo numa cuvete de 5 mm. O ajuste da curva revela uma frequência de natação Hz ~ 2,7.

Figura 6. A linha superior representa os padrões de difração de reais e é comparado com os padrões de difração modelados na linha de fundo. Os padrões de difracção modeladas foram produzidas usando vermes sobre uma lâmina de microscópio (linha do meio).

Discussão

Nós desenvolvemos uma nova abordagem para a medição em tempo real, de circulação e de comportamentos simples locomotor em organismos microscópicos como nemátodos que não requer a utilização de microscópios. ⁸ Esta abordagem metodológica também poderiam ser utilizados para o estudo de vários organismos microscópicos como protistas. Este método só é limitada pelo comprimento de onda da luz utilizada. O organismo não deve ser menor do que o comprimento de onda da luz. Além da economia de custos e a portabilidade do equipamento necessário, uma vantagem desta abordagem é a possibilidade de medir o comportamento em tempo real e em três dimensões, sem as limitações estreitas de planos de imagem sob um microscópio. É também possível com esta técnica para examinar influências das forças gravitacionais ou numerosas outras condições de comportamento que não podem ser estudados utilizando as abordagens baseadas em microscópio. ⁹ Assim, pode-se obter uma melhor compreensão do microorganismo natural, locomotora comportaviors libertados a partir dos limites de gotículas de lâmina de microscópio ou câmaras especializadas microfluídicos (Park et al, 2008). ¹⁰

A falta de informação de fase num modelo de difracção não permite a recuperação directa de a imagem correspondente ao objeto difração desde que o padrão de difracção de campo distante é proporcional ao quadrado do valor absoluto da transformada de Fourier. Estamos portanto calcular padrões de difracção a partir de imagens de vermes de modo que possam ser comparados com os padrões de difracção de nemátodos livremente natação (Figura 6).

Este método produziu resultados para realmente nadar livremente C. elegans e pode ser aplicado a qualquer espécie microscópicos que manobras em um ambiente opticamente transparente como a água ou diversas soluções iónicas. Microscópios convencionais só permitem estudos com uma profundidade focal da ordem de micrômetros. ¹¹ Isto é devido à limitadaprofundidade de campo quando o foco de luz:

em que o número f-N tem uma relação de reciprocidade com o círculo de confusão (c) de modo que uma distância focal curta está associado a uma grande c. ^12,13 Embora este método de difracção não é certamente um substituto para microscopia convencional, é capaz para fornecer resultados quantitativos rapidamente, de modo que mesmo as espécies podem ser manipulados em tempo real a baixo custo. Os padrões de difracção pode ser obtida com qualquer ponteiro laser. Os padrões de difração pode ser filmado em uma resolução reduzida temporal utilizando uma câmera digital comum. Enquanto o usuário não pode ter um microscópio ou um fotodiodo prontamente disponíveis, as peças-chave deste experimento, como medir freqüências debulhando e avaliar os padrões de difração pode ser concluída a um custo extremamente baixo.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
543 nm Laser HeNe	Melles Griot	LGX1	Qualquer laser na gama do visível, com menos do que 5 mW pode ser usado.
2 Os espelhos de alumínio superfície frontal	Thorlabs	PF10-03-F01
High Speed ​​Exilim Câmara	Casio
Quartzo Cuvette	Células Starna	21/G/5
LoggerPro (Software)	Vernônio		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8	Volfrâmio		http://www.wolfram.com/