Em síntese in vitro de Nativo, Espaçamento fibroso Long e Colágeno Espaçamento segmentar Longo

Resumo

Procedimentos simples e reprodutíveis são descritos por fazer três conjuntos de colágeno estruturalmente distintos de um tipo comum disponível comercialmente eu monômero de colágeno. Tipo nativo, o espaçamento de tempo de colagénio fibroso ou espaçamento segmentar longo pode ser construído através da variação das condições a que os 300 nm de comprimento e 1,4 nm de diâmetro bloco de construção de monómero é exposta.

Resumo

Fibrilhas de colagénio estão presentes na matriz extracelular de tecido animal para fornecer um andaime estrutural e resistência mecânica. Estas fibrilas de colagénio nativo tem uma periodicidade característica de bandas de ~ 67 nm e são formados in vivo, através do conjunto hierárquico de monómeros de colagénio do Tipo I, que são de 300 nm de comprimento e 1,4 nm de diâmetro. In vitro, através da variação das condições a que a blocos de construção monoméricos são expostos, estruturas únicas que variam em escalas de comprimento até 50 microns pode ser construído, incluindo não só as fibras do tipo nativo, mas também fibras de colagénio e espaçamento de longo prazo espaçamento segmentar. Este trabalho apresenta os procedimentos para a formação das três estruturas diferentes de colagénio a partir de um monómero de colagénio comum disponível comercialmente. Utilizando os protocolos que nós e outros já publicados no passado para fazer estes três tipos tipicamente levam a misturas de estruturas. Em particular, fibrilas unbanded eram geralmente found ao fazer colágeno nativo, e fibras nativas foram muitas vezes presente na tomada de colágeno fibroso espaçamento longo. Estes novos procedimentos têm a vantagem de produzir o desejado tipo de colagénio fibrilar quase exclusivamente. A formação das estruturas desejadas é verificada por imagem usando um microscópio de força atómica.

Introdução

O colagénio é uma classe de proteínas estruturais que têm uma estrutura helicoidal tripla formada a partir de três cadeias polipeptídicas. Estes monómeros helicoidais triplas adicionais montar de uma maneira hierárquica de modo a formar estruturas progressivamente maiores. Existem pelo menos 28 tipos de colagénio geneticamente diferentes que foram identificadas ^1. Combinados, colágenos representam 30% do total de proteínas encontradas em animais, do tipo I, a contabilidade de forma predominante para até 90% de todas as proteínas de colágeno ^2. O colágeno tipo I é encontrado como estruturas fibrillous na pele, ligamentos, tendões e ossos. Microscópio de força atômica (AFM) e microscopia eletrônica (ME) imagens de Tipo I fibras de colágeno nativo normalmente mostram faixas com um período característico de ~ 67 nm (muitas vezes referido como D-faixas) ^3-5.

O tipo I é um monómero de colagénio helicoidal triplo heterotrimero constituído por dois α1 idênticos (I) e uma cadeia α2 (I) de cadeia, cada um mais do que ummil aminoácidos de comprimento. É longo e fino com dimensões de 300 nm de comprimento e 1,4 nm de diâmetro. Colagénio do tipo I de monómero pode ser prontamente obtido por decomposição formados naturalmente estruturas de ordem superior ^6. Nós ⁷ e ^8-10 muitos outros têm mostrado que estes blocos de construção monoméricos solúveis em seguida, pode ser usado para reconstruir D-bandados fibrilhas in vitro (Figura 1).

Além de fibrilhas de colagénio nativo, duas outras estruturas mais elevadas de colagénio de ordem foi encontrado para formar in vitro, utilizando o bloco de construção mesmo monómero. As duas estruturas são espaçamento longo fibroso (FLS) e um espaçamento de longo segmentar (SLS) colágeno (Figura 1). FLS colagénio é uma construção fibrillous como colagénio nativo, mas é caracterizada por uma maior periodicidade bandas de colagénio nativo ^11. In vitro, o colagénio FLS forma quando o monómero é combinada com colágeno α1-glicoproteína ácida ^{12. FLS colagénio tem sido observada in vivo, bem como, embora raramente 13. Colagénio SLS é descrito como cristais porque os monómeros são alinhados no registo como numa estrutura de cristal 14. SLS colagénio forma-se quando o monómero de colagénio é combinado com o trifosfato de adenosina (ATP) 15. Que ocorre naturalmente colagénio SLS foi observado no meio de cultura de fibroblastos, mas não em amostras de tecido extraídos, provavelmente devido ao seu pequeno tamanho e falta de características topográficas distintas 16.}

O objetivo deste artigo é apresentar os procedimentos detalhados para a tomada de fibrilas de colágeno nativas como FLS bem e colágeno SLS que mesmo o pesquisador mais inexperiente pode reproduzir. Usando disponíveis comercialmente a partir de materiais avançados, temos tentado fazer os protocolos tão simples quanto possível e ainda tê-los funcionar de forma confiável. Nós também detalhes como usar um AFM para caracterizar a estrutura do colágeno diferentes que são feitas. Este trabalho será benéfico para pesquisadores que querem estudar uma ou mais dessas estruturas superiores de colágeno de ordem e / ou utilizá-los como precursores em outras aplicações, mas que não têm o conhecimento ou simplesmente não querem trabalhar com amostras de tecido.

Protocolo

NOTA: A água utilizada em todos os protocolos tem uma resistividade> 18 MΩ.cm.

1. Nativas fibrilas de colágeno

1. Combinar 6 ul de água, 20 ul de 200 mM de Na ₂ HPO ₄ ajustada a pH 7 com HCl e 10 ul de 400 mM de KCl, em um tubo de microcentrífuga e misturar.
2. Adicionar 4 ul de colagénio monómero (~ 3 mg / ml em HCl 0,01 N) ao tubo de microcentrífuga e misturar. A solução deve ser límpida e incolor.
3. Colocar o tubo de microcentrífuga contendo a mistura de reacção num bloco de aquecimento que tenha sido pré-aquecido a 37 ° C, deixando repousar durante 3-4 horas. Neste ponto, a solução deve ser ligeiramente turva e contêm fibrilas de colagénio principalmente nativas.

2. Colágeno Espaçamento fibroso Longo

1. Dializar 1 ml de colágeno monómero (~ 3 mg / ml em HCl 0,01 N), utilizando 12-14 kDa membrana MWCO contra 400 ml de água, trocando a água quatro vezes ao longo de um período de 24 horas à temperatura ambiente. O collag dialisadoen monómero que não é usado de imediato pode ser armazenado a 4 ° C para uso futuro.
2. Combinar 20 ul de água, 20 ul de 3 mg / ml de ácido glicoproteína α1-em-água e 20 ul de monómero de colagénio dialisada em tubo de microcentrífuga. A solução deve ser límpida e incolor.
3. Deixar o tubo de microcentrífuga contendo a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 30 min. Neste ponto, a solução deve ser turva e contêm fibrilas de colagénio predominantemente FLS.

3. Colágeno Espaçamento segmentar Longo

1. Combinar 67 ul de água, 60 ul de 100 mM de tampão de glicina-HCl a pH 3,3 e 40 ul de 10 mg / ml em ATP água em um tubo de microcentrífuga e misturar.
2. Adicionar 33 ul de colagénio monómero (~ 3 mg / ml em HCl 0,01 N) ao tubo de microcentrífuga e misturar. A solução deve ser límpida e incolor.
3. Deixar o tubo de microcentrífuga contendo a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 2 hr. Neste ponto, a solução continua a aparecer claro, mas deveconter colágeno principalmente SLS.

4. AFM Caracterização

1. Clivar a superfície de uma parte de mica ligado a um substrato de AFM, cobrindo a superfície de mica com um pedaço de fita adesiva e, em seguida, descascando-lo fora. Verifique a fita depois de confirmar que toda uma camada de mica foi clivado, a fim de reduzir as irregularidades na superfície e garantir que a amostra é removida de idade se a mica está a ser reutilizado.
2. Aplicar 20 ul da solução de colagénio fibrilar para o substrato de mica clivada de fresco. Deixar durante 5 minutos.
3. Gentilmente enxaguar solução de colágeno fibrilar com água. É aconselhável não aplicar a água directamente sobre o centro do substrato de mica, mas na borda e para permitir que ele flua através da amostra.
4. Seque a superfície sob uma corrente suave de azoto gasoso. É aconselhável para dirigir o fluxo na borda e não no centro do substrato de mica.
5. Sob um microscópio óptico de ampliação em 200 ×,as amostras de colágeno nativo e FLS deve mostrar aglomerados de fibras. Colágeno SLS não será visível.
6. As características únicas dos três estruturas diferentes de colagénio são observáveis ​​por AFM. Geralmente, nós, imagem nativa fibrilas de colágeno com um AFM no modo de contato intermitente com sondas de silício AFM, enquanto FLS e colágeno SLS fibrilas nós imagem tipicamente com um AFM no modo contato usando sondas de nitreto de silício AFM. Fazemos isso por causa do tempo e considerações de custo. Sondas de silício AFM são geralmente mais cortante do que as sondas de nitreto de silício de AFM, que os tornam particularmente úteis para imagiologia da estrutura de bandas mais estreitas de fibrilhas de colagénio nativo. Contudo, as sondas de silício AFM são muito mais propensos a contaminação por amostras de colágeno do que as sondas de nitreto de silício AFM e precisa ser substituído com frequência. Portanto, nós nos reservamos o uso de sondas de silício AFM principalmente para fibrilas de colágeno imagem nativas em que a resolução é uma maior necessidade e que operam em modo de contato intermitente prolong toda a sua vida de utilidade.

Recomendamos uma inicial de 100 × 100 fim ² varredura que deve mostrar pelo menos construções colágenas. A partir daí, o zoom, para fazer a varredura em tamanhos de 10 x 10 ^ M ² e, em seguida 2 x 2 m ² para observar a periodicidade de bandas de colagénio nativo e FLS, ou as características mais finas de um colagénio SLS. Também é uma boa ideia para verificar pelo menos duas outras regiões da amostra de colagénio para verificar que as verificações iniciais são representativos.

Resultados

Colágeno nativo

A mistura de reacção de monómeros de colagénio ~ 0,3 mg / ml em 100 mM de fosfato de KCl e 100 mM a pH 7, à esquerda, a 37 ° C durante 3-4 horas irá produzir uma solução que contém fibras de colagénio nativo de tipo com clara ~ 67 nm D-bandas, sem fibrilas unbanded.

Sob um microscópio óptico de ampliação a 200 ×, aglomerados de fibras de várias podem ser visto normalmente sobre o substrato de mica em particular quando visualizado por contraste de interferência diferencial (DIC) microscopia (Figura 2). Num exemplo típico, um 100 × 100 um aleatório ² digitalização por AFM normalmente apresentam pelo menos alguns que são fibrilas 5-50 microns de comprimento (Figuras 3a-c). Individual, fibrilas de colagénio separados podem ser facilmente identificados na presente fase. Com uma varredura de pixel 512 512 × imagem ^2, zoom em um tamanho de 10 10 pM × scan ² mostra que todas as fibrilas estão em faixas (Figuras 3d-f ). A fim de medir com precisão a periodicidade de bandas, é melhor para aumentar o zoom em um 2 × 2 m tamanho de digitalização ² (Figuras 3g-i).

Bandeamento periodicidade pode ser determinada por simples medição e calculando a média da distância longitudinal entre vários picos ou vales. Alternativamente, se o software permite AFM, um Fourier unidimensional ao longo de uma transformação corte longitudinal podem também ser usados. Figura 4 mostra uma imagem AFM altura de uma fibrila e uma correspondente secção transversal longitudinal.

FLS colágeno

A mistura de reacção de 1 mg / ml de ácido-glicoproteína μ1 e 1 ~ monómero colagénio mg / ml em água deixada à temperatura ambiente durante 30 minutos irá produzir uma solução de fibrilas de colagénio FLS.

Aglomerados de fibras, semelhante à que se observa no caso do colagénio nativo, pode ser facilmente visto sobre o substrato de mica com um microscópio óptico a 200 × magnification. Em uma amostra típica, um aleatório de 100 × 100 fim ² varredura por AFM normalmente irá mostrar pelo menos algumas fibrilas. Com um 512 x 512 pixel de tamanho da digitalização da imagem ^2, a periodicidade de bandas pode ser medido por um zoom em 10 x 10 um ² scan (Figura 5a) ou, mais precisamente, com uma 2 x 2 m ² de varredura (Figura 5b). Figura 5c mostra uma secção transversal longitudinal de uma fibrila FLS.

SLS colágeno

A mistura de reacção de 2 mg / ml e ATP ~ 0,5 mg / ml de colagénio de monómero em 100 mM de tampão de glicina-HCl a pH 3,3 foi deixada à temperatura ambiente durante 2 horas vai produzir uma solução de colagénio SLS.

Normalmente, cristalitos SLS não será visível ao microscópio óptico. Um AFM é necessária para confirmar a presença dos cristalitos SLS. Em uma amostra típica, um aleatório de 100 × 100 fim ² varredura por AFM normalmente irá mostrar muitospontos. Zoom em um 10 de 10 um × ² varredura normalmente irá mostrar vários cristalitos SLS (Figura 6). E um 2 x 2 m ² de varredura (Figura 6b) mostra a estrutura fina de um cristalito SLS.

Figura 1. As três formas estruturalmente diferentes de fibrilas de colagénio que podem ser formados in vitro a partir de monómeros de colagénio. Imagens de AFM mostrando monômero de colágeno e as três estruturas superiores de colágeno ordem tudo na escala de mesmo tamanho (2 × 2 m ^2).

Figura 2. Imagem digital em ~ ampliação × 200 por microscopia óptica DIC de fibrilas de colágeno nativo em mica (a) intocado e (b) limiarizadas e afiada tó destacar as fibrilas.

Imagens Figura 3. AFM de fibrilas de colágeno nativo em mica. Intermitentes de contacto modo imagens de AFM de amplitude são mostradas.

Figura 4. (A) 0,5 × 1 um ² modo intermitente contacto imagem AFM altura (escala vertical = 100 nm) e (b) secção transversal longitudinal de um nativo do colagénio fibrilar.

Figura 5. Imagens AFM de fibrilhas de colagénio sobre FLS mica. (A) 10 × 10 um ² contacto modo deflexão imagem AFM, (b) 2 x 2 m ² de contactos de modo de imagem deflexão AFM e (c) longitudinalsecção transversal de uma fibrila de colagénio FLS.

Figura 6. Imagens AFM de SLS colagénio em mica. Intermitentes de contacto modo imagens de AFM de amplitude são mostradas.

Discussão

Purificou-monómero de colagénio é estável a pH baixo e temperatura e a formação de fibrilhas de colagénio nativo essencialmente envolve o aumento do pH e temperatura da solução de monómero de colagénio. Procedimentos para a reconstituição de fibrilas de colágeno em faixas de monômeros existem há mais de 50 anos. O procedimento que o nosso laboratório usado nos nossos primeiros estudos com colagénio de 15 anos atrás ⁷ foi baseada em procedimentos resumidos por Chapman e colaboradores em 1986 ^10. As condições para a formação de fibrilas de colagénio em que trabalhos anteriores foram 0,18 mg / ml de colagénio em monómeros de Na ₂ HPO ₄ / KH ₂ PO ₄ (I = 0,2, pH 7,4) tampão a 34 ° C. O inconveniente deste e de outros procedimentos que tentámos é que existem sempre fibrilas unbanded formadas juntamente com as fibrilas desejados sombreadas. As nossas novas condições são ~ 0,3 mg / ml de colagénio em monómeros fosfato 100 mM e 100 mM de KCl, a pH 7 deixados a 37 ° C durante 3-4 horas. O procedimentomento aqui descrito difere em todos os aspectos do processo anterior para a tomada de fibrilhas de colagénio nativo. Mas o mais notavelmente, dobramos a força iónica, aumentando a concentração de tampão e adição de 100 mM de KCl. O aumento da força iônica na formação mais consistente de fibrilas de colágeno exclusivamente em faixas.

Em nossa experiência, as únicas vezes que este procedimento não tem produzido o colágeno tipo nativo foi quando a solução de monômero de colágeno foi passado data recomendada pelo fabricante de uso. Quando isto ocorre, o que é observado varia de menos fibrilas que são todos unbanded para muitas fibrilas ainda observados, mas predominantemente unbanded. Note que monômero colágeno expirado muitas vezes pode ainda ser utilizado com sucesso para fazer colágeno nativo, mas quando falha, o monómero de novo colágeno deve definitivamente ser comprado.

FLS foi identificado pela primeira vez por Highberger et al. ¹⁷ em preparações de colagénio creditados Orekhovich et al. ^18. Mais estudos levaram Highberger e Schmitt a concluir que se tratava de glicoproteína α1-ácido que promove a formação de FLS ^12. Nós foram posteriormente capaz de replicar o procedimento para fazer o colagénio FLS pela combinação de monómero de colagénio disponíveis comercialmente e α1-glicoproteína ácida a pH baixo e, lentamente, permitindo que o pH a subir por diálise da mistura contra água durante 24 h ^11. Apresentamos agora uma modificação do referido processo de diálise por o monómero de colagénio contra água em primeiro lugar e simplesmente combinando-o com α1-glicoproteína ácida em água para formar colagénio FLS. As condições para FLS colagénio montagem aqui descritos são muito menos demorado. O monómero de colagénio ainda necessita de ser pré-dialisado contra água, mas ele pode ser feito em grandes quantidades e, em seguida, armazenada a 4 ° C de forma estável até ser utilizado. Isso gera novo procedimento predominantemente fls fibrilas de colágeno bandados.

Pela nossa experiência, α1-ácido glicoproteína com um teor de proteína e água inferior combinado, e, por inferência, maior teor de açúcar, é fundamental para o sucesso fazendo fibrilas de fls. Nós normalmente verificar com o fabricante que o lote glicoproteína α1-ácido que usamos tem um combinado% de teor de proteína e água de 82 ou menos. E, como com o procedimento para a síntese de colagénio nativo, de monómero de colagénio que é demasiado antigo pode também resultar na incapacidade de produzir colagénio FLS. Além disso, a pureza da água utilizada para a diálise é crítica neste processo. Por exemplo, a diálise do monómero de colagénio mesmo contra ~ 8 MΩ.cm vez de> 18 água resulta MΩ.cm em uma solução de colagénio que não irá formar colagénio FLS.

Um dos três tipos de colagénio de fibrila, o mais fácil de fazer é colagénio SLS. A primeira preparação de SLS foi descrito por Schmitt e colegas de trabalho ^15. Nós publicamos uma adaptação desse procedimento há 12 anos para fazer colágeno SLS usando coll disponível comercialmenteagen ^14. O procedimento implica simplesmente combinar 2 mg / ml de ATP e 0,5 mg / ml de colagénio em monómeros de 0,05% (v / v) de ácido acético a pH 3,5, e deixando a mistura à temperatura ambiente durante a noite.

Na nossa experiência, o aspecto crítico da montagem SLS que deve ser controlado é o pH da solução de reacção. SLS montado em condições mais básicas (~ pH 3,6-3,9) resulta em aglomerados de agregados de cristalitos. Condições mais ácidas (pH ~ 2,9-3,2) resulta em mais finas, cristalitos mais separados do que os montados sob as condições ideais de pH 3,3-3,5. PHs reação fora deste intervalo (<2,8 e> 4) não produzem qualquer colágeno SLS. No passado, foi ajustado o pH da mistura de reacção por adição de ácido acético. Para simplificar o processo ainda mais, neste manuscrito, introduzimos um tampão de glicina-HCl para controlar o pH.

As três estruturas diferentes de colagénio formadas a partir dos protocolos descritos acima têm caráctercaracterísticas humanístico que só pode ser discernido por instrumentos capazes de resolução de nanômetros. Colágeno nativo e FLS são caracterizados por bandas periodicidades de ~ 67 nm e ~ 270 nm. A dimensão mais longa do colagénio SLS é apenas ~ 360 nm. Nós descrevemos especificamente como usamos um AFM para caracterizar as três estruturas de colágeno diferentes. No entanto, qualquer operação AFM em contacto ou o modo de contacto intermitente com qualquer sonda de AFM com 19.

A principal vantagem destes processos é que eles produzem, predominantemente, o colagénio desejado construir. A única outra forma de colagénio que se encontra nestas reacções é o monómero de partida, o que é muitas vezes visível no fundo das imagens de AFM. No caso do colagénio nativo e FLS, eles podem ser facilmente separados a partir de mais do unreamonómero CTED por centrifugação repetida e lavagem do resultante nativo ou colagénio FLS pellet com água.

Apresentámos procedimentos simples e fiável para a tomada nativas, FLS e colagénio SLS utilizando avançadas, materiais de partida disponíveis comercialmente. O monómero de colagénio utilizada em todos estes processos é comercialmente disponível na forma purificada. α1-glicoproteína ácida e ATP também estão ambos disponíveis comercialmente.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material / reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Colagénio do tipo I de monómero (~ 3 mg / ml em HCl 0,01 N)	Inamed Avançado Biomatrix	5409 5005-B	Lote 1261443 (2,9 mg / ml, pH 2,1) Lote 1629346 (3,2 mg / ml, pH 2,1) Lot 6006 (3,2 mg / ml, pH 2,1)
ATP	Bioquímicos de investigação internacionais	A-141	Lote FBJ-1194A
α1-glicoproteína ácida a partir de plasma de bovino	Sigma-Aldrich	G3643	Lote 051K7440 (89,8%) Lote 011K7410 (82%) Lote 065K7405 (71,2%) Lote 063K7495 (71,9%) Lote 117K7535 (75,9%) (Proteína teor de água +)
a1-ácido glycoprotein de plasma humano	Sigma-Aldrich	G9885	Lote 128H7606 (70,9%) Lote 049K7565V (68%) (Proteína teor de água +)
mica	Ted Pella	53
Pointprobe - Silicon SPM-Sensor	Nanoworld	NHC	Silício AFM sonda que nós usamos para o modo de contato intermitente
Nanoprobe Dicas Veeco	Veeco (Agora sondas Bruker AFM)	NP-S	Nitreto de silício sonda de AFM que usamos para o modo de contato