Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

Resumo

Descrita é um processo de rotulagem em duas etapas usando β-glicosiltransferase (β-GT) para transferir uma azida de glucose para 5 HMC, seguido por química do clique para transferir de um ligante de biotina para o enriquecimento fácil e densidade independente. Este método de marcação eficiente e específico permite o enriquecimento de 5 HMC com fundo extremamente baixo e de alto rendimento de mapeamento epigenômico via sequenciamento de última geração.

Resumo

5-metilcitosina (5-mC) constitui ~ 2-8% das citosinas totais no DNA genómico humano e um impacto de uma ampla gama de funções biológicas, incluindo a expressão de genes, a manutenção da integridade do genoma, a impressão parental, inactivação do cromossoma X, a regulação dos desenvolvimento, envelhecimento, cancro e ^1. Recentemente, na presença de um oxidado 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5 HMC), foi descoberto em células de mamíferos, em particular no estaminais embrionárias (ES) e células neuronais ^2-4. 5 HMC é gerado por oxidação de 5-mC catalisada por TET família de ferro (II) / α-cetoglutarato-dependente dioxigenases ^{2, 3.} 5 HMC é proposto para ser envolvido na manutenção de células estaminais embrionárias (MES), a hematopoiese normal e doenças malignas, e o desenvolvimento do zigoto ^{2, 5-10.} Para melhor compreender a função da 5-HMC, um sistema de sequenciação fiável e simples é essencial. Seqüenciamento bissulfito tradicional não pode distinguir 5 HMC de 5-MC ¹¹ 12.

Aqui descrevemos um procedimento em duas etapas simples para rotulagem química seletiva de 5-HMC. No passo de rotulagem em primeiro lugar, 5 HMC em ADN genómico é marcado com um catalisada 6-azida-glucose por β-GT, uma glicosiltransferase de bacteriófago T4, de uma maneira que transmite a 6-azida-glucose a 5 HMC do cofactor modificado, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). No segundo passo, biotinilação, de um ligante de biotina de dissulfureto é ligado ao grupo azida por química do clique. Ambos os passos são altamente específicos e eficiente, levando à completa marcação, independentemente da abundância de 5 HMC em regiões genómicas e dando de fundo extremamente baixos. Seguindo a biotinilação de 5 HMC, os fragmentos de 5 HMC contendo ADN são então selectivamente capturadautilizando contas de estreptavidina de um modo independente de densidade. Os fragmentos resultantes de 5 HMC enriquecidas de DNA pode ser utilizado para as análises a jusante, incluindo a última geração de sequenciação.

Nossa marcação selectiva e protocolo de captura confere alta sensibilidade, aplicável a qualquer fonte de DNA genômico com variáveis ​​/ diverso 5 HMC-abundâncias. Embora o objetivo principal deste protocolo é a sua aplicação a jusante (ou seja., Sequenciamento de última geração para mapear a distribuição de 5 HMC no genoma), é compatível com molécula única, em tempo real SMRT (DNA) de seqüenciamento, que é capaz de fornecer uma única base de sequenciação de resolução de 5 HMC.

Protocolo

1. A fragmentação de ADN genómico

Fragmento de ADN genómico utilizando sonicação de uma gama de tamanhos desejada adequada para a plataforma de sequenciamento do genoma. (Nós normalmente sonicar a ~ 300 pb.) Verificar a distribuição do tamanho do ADN genómico fragmentado em 1% de gel de agarose (Figura 1).

2. Preparação de ADN

Determinar as quantidades de ADN a partir baseadas na abundância de 5 HMC em ADN genómico. Desde 5-HMC níveis variam significativamente em diferentes tipos de tecidos, quantidades de DNA a partir dependem dos níveis de 5-HMC das amostras. Por favor, consulte a Tabela 1 para exemplos.

3. β-GT reacção catalisada (reacção de transferência de Glicose)

1. Misturar por pipetagem da mistura, como detalhado na Tabela 2 e incuba-se em um banho de água a 37 ° C durante 1 h.
2. Após a incubação, limpar-se a mistura reaccional com remoção Kit QIAquick Nucleotide, utilizando 10 jig de DNA porcoluna. Eluir com 30 ul de água por coluna e combinar.

4. Reação Biotinilação (Clique Química)

1. Adicionar DBCO-SS-PEG3-biotina conjugado de solução de trabalho (1 mM) na solução de ADN eluído (do passo 3) para uma concentração final de 150 uM (ou seja, 5 uL de solução de trabalho por 30 ul de solução de ADN).
2. Misturar por pipetagem, e incubar em banho de água a 37 ° C durante 2 horas.
3. Limpe a reação com QIAquick Removal Kit Nucleotide. O volume de eluição total ideal é de 100 uL.
4. Quantificar a quantidade de DNA recuperado usando microlitro espectrofotômetro escala (por exemplo., NanoDrop).

5. Captura de 5 HMC contendo DNA

1. Lave 50 ul de Dynabeads MyOne Estreptavidina C1 3 vezes com 1 ml de 1X tampão B & W de acordo com as instruções do fabricante. Separa-se as pérolas com um suporte magnético.
2. Adicionar um volume igual de 2X tampão B & W para o D recuperado biotiniladoNA (100 ul) às pérolas lavadas.
3. Incubar durante 15 min à temperatura ambiente com rotação suave num agitador rotativo.
4. Separa-se as pérolas com um suporte magnético e lavar as pérolas três vezes com 1 ml de 1X tampão B & W.
5. Eluir o DNA através da incubação as pérolas em 100 ul de DTT mM preparada de fresco 50 durante 2 h à temperatura ambiente, com rotação suave num agitador rotativo.
6. Separa-se as pérolas com um suporte magnético. Aspirar o eluente e uma carga para Micro Bio-Spin 6 Coluna de acordo com a instrução de fabrico para remover o DTT. O ADN alvo é a solução agora.
7. Purifica-se o DNA eluído a partir do passo anterior, Qiagen Purification Kit MinElute PCR DNA e elui-se em 10 ul de tampão EB. Quantificar DNA usando Fluorometer Qubit ou NanoDrop se a concentração é superior a 20 ng / ul. O DNA está pronto para jusante preparação biblioteca genômica sequenciação.

6. Resultados representativos

Se a qualidade de of DNA genómico é elevada, o rendimento de recuperação típicos após a β-GT e reacções de biotinilação são ~ 60-70%. No entanto, a eficiência da captação variar significativamente com os tipos de tecidos diferentes, dependendo dos níveis de 5-HMC das amostras. Normalmente, a eficiência da captação de DNA genómico cérebro é ~% 4-9, e, em alguns casos extremos, a eficiência pode atingir até 12%. No caso de células ES, a eficiência da captação média é de aproximadamente 2-4%, em contraste com a ~ 0,5% para as células estaminais neurais. A menor eficiência visto até agora foi para o DNA genômico de células cancerosas. Todos DNA enriquecido está pronto para o padrão da próxima geração de protocolos de preparação de bibliotecas. Além disso, o ADN capturado pode também ser usado como molde para a PCR em tempo real para detectar o enriquecimento de alguns fragmentos em comparação com o ADN de entrada, se os iniciadores relacionados estão disponíveis.

Figura 1. Sonicados fragmentos genómicos humanos de DNA em1% de gel de agarose. De 10 ug de DNA genómico isolado a partir de células humanas do iPS em 120 ul de tampão TE 1X foi sonicada usando um dispositivo de ultra-sons (Covaris). Após sonicação, 2 ul do DNA sonicado foi carregada num gel de agarose a 1% utilizando 100 pb do marcador de DNA para comparar os tamanhos dos fragmentos de DNA sonicados.

Componente	Volume	Concentração Final
Água	_ Ul
10 X tampão de reacção β-GT	2 ul	1 X
Até 10 ug de ADN genómico	_ Ul	Até 500 ng / uL
UDP-N-6, 3-Glc (3 mM)	0,67 ul	100 uM
β-GT (40 uM)	1 ul	2 uM
Volume total	20 ul

i) Para o DNA genômico de tecidos (conteúdo 5 HMC alta> 0,1%)

Componente	Volume	Concentração Final
Água	_ Ul
10 X tampão de reacção β-GT	10 ul	1 X
Até 20 ug de ADN genómico	_ Ul	Até 500 ng / uL
UDP-6-N3-Glc (3 mM)	Ul 1,33	100 uM
β-GT (40 uM)	2 ul	2 uM
Volume total	40 ul

ii) Para o ADN genómico de células estaminais (mediana 5 HMC conteúdo ~ 0,05%)

Componente	Volume	Concentração Final
Água	_ Ul
10 X tampão de reacção β-GT	10 ul	1 X
Até 50 ug de ADN genómico	_ Ul	Até 500 ng / uL
UDP-6-N3-Glc (3 mM)	3,33 ul	100 uM
β-GT (40 uM)	5 ul	2 uM
Volume total	100 ul

iii) Para o câncer de DNA genômico de células (conteúdo 5 HMC baixo ~ 0,01%)

Tabela 1. Exemplos de quantidades de ADN de entrada e de reacções de etiquetagem utilizando as amostras com diferentes níveis de HMC-5 através do método selectivo química rotulagem.

Amostra	5 HMC nível	ADN de partida (mg)	A recuperação após a etiquetagem (entrada de esferas) (ig)	Rendimento de recuperação	Pull-down DNA (ng)	Puxe para baixo rendimento
Cerebelo do rato adulto	0,4%	10	7,5	75%	236	3,1%
Pós-natal do rato 7 dias cerebelo	0,1%	11	9	82%	140	1,6%
Rato de células ES E14	0,05%	60	42	70%	350	0,8%

Tabela 2. Resultados representativos a partir de tecidos e células do cérebro de rato ES.

Discussão

5-hydroxymethylcytosine (5 HMC) é uma modificação do presente recentemente identificado epigenética em quantidades substanciais em certos tipos de células de mamíferos. O método aqui apresentado é para determinar a distribuição de todo o genoma de 5 HMC. Usamos bacteriófago T4 β-glicosiltransferase para transferir uma porção glucose engenharia contendo um grupo azida para o grupo hidroxilo de 5 HMC. O grupo azida pode ser quimicamente modificados com biotina para a detecção, o enriquecimento por afinidad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Companhia	Catalogo	Comentário
			Reagentes
O cloreto de sódio 5 M (NaCl)	Promega	V4221
PH 8,0 0,5 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Promega	V4231
1M Trizma base (Tris) pH 7,5	Invitrogen	15567-027)
HEPES 1M, pH 7,4	Invitrogen	15630
Cloreto de magnésio (MgCl2) 1M	Ambion	AM9530g
Dimetil-sulfóxido (DMSO)	Sigma	D8418
Tween 20	Fisher biorreagentes	BP337-100
DBCO-SS-PEG3-biotina conjugado	Clique em Ferramentas Química	A112P3
1,4-Ditiotreitol, ultrapura (TDT) suprapuro	Invitrogen	15508-013
QIAquick Removal Kit Nucleotide	Qiagen	28304
Micro Bio-Spin 6 Coluna	Bio-Rad	732-6222
Dynabeads MyOne	Invitrogen	650-01
Estreptavidina C1
Qiagen MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
UDP-6-N 3-glucose	Motivo ativa	55013
			Enzima
β-glicosiltransferase (β-GT)	New England Biolab	M0357
			Equipamento
Dispositivo sonicação	Covaris
Centrífuga de mesa
Banho de água	Fisher Scientific
Aparelho de gel de corrida	Bio-Rad
NanoDrop1000	Thermo Scientific
Labquake Tubo Shaker	Barnstead
Labquake Tubo Shaker	Thermolyne
Suporte de Separação Magnética	Promega	Z5342
Qubit 2,0 Fluorometer	Invitrogen
			Configuração de reagente 10 X Reacção β-GT tampão (500 mM de HEPES pH 7,9, 250 mM de MgCl 2) 2 X de ligação e de lavagem (B & W) de tampão (10 mM Tris pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 2 M, Tween a 0,02% 20) .