Multi-analito Biochip (MAB) Com base em eletrodos íon-seletivos All-solid-state (ASSISE) para a pesquisa fisiológica

Resumo

Eletrodos íon-seletivo All-solid-state (Jornadas) construídos a partir de um polímero (CP) transdutor condutor fornecer vários meses de vida funcional em meio líquido. Aqui, descrevemos o processo de Jornadas em um formato de lab-on-a-chip fabricação e calibração. O ASSISE é demonstrado ter mantido um perfil de encosta quase Nernstiana após armazenamento prolongado em meios biológicos complexos.

Resumo

Aplicações Lab-on-a-chip (LOC) em pesquisa ambiental, biomédico, agrícolas, biológicos e vôos espaciais exigem um eletrodo íon-seletivo (ISE), que podem suportar o armazenamento prolongado em meios biológicos complexos ^1-4. Um íon-seletivo-eletrodo all-solid-state (ASSISE) é especialmente atraente para as aplicações mencionadas. O eletrodo deve ter as seguintes características favoráveis: construção fácil, baixa manutenção, e (potencial) de miniaturização, permitindo o processamento em lote. Um ASSISE microfabricado destinadas à quantificação de H ^+, Ca ^{2 +} e CO ₃ ^{2 -} iões foi construído. É constituída por uma camada de metal nobre do eléctrodo (isto é, Pt), uma camada de transdução, e uma membrana selectiva de iões (ISM) camada. As funções da camada de transdução de transduzir o potencial químico dependente da concentração da membrana selectiva de iões num sinal eléctrico mensurável.

Tele tempo de vida de um ASSISE é encontrado para dependem da manutenção do potencial de a camada de membrana / interface de ^5-7 condutora. Para prolongar o tempo de vida útil ASSISE e, assim, manter os potenciais estáveis ​​nas camadas interfaciais, utilizamos o condutor polímero (CP) de poli (3,4-etilenodioxitiofeno) (PEDOT) ^7-9 no lugar de prata / cloreto de prata (Ag / AgCl) como camada de transdutor. Construímos o ASSISE em um formato de lab-on-a-chip, que chamamos o biochip multi-analito (MAB) (Figura 1).

As calibrações em soluções de ensaio demonstrou que o MAB pode monitorar o pH (gama operacional de pH 4-9), CO ₃ ^{2 -} (medido gama de 0,01 mM - 1 mM), e ^{Ca2 +} (intervalo de log-linear de 0,01 mM a 1 mM). O MAB para pH fornece uma resposta encosta quase Nernstiana depois de quase um mês de armazenamento em meio de algas. Os biochips carbonato apresentam um perfil potenciométrica semelhante à de um eléctrodo selectivo de iões convencional. Fisiológicoogical medições foram utilizados para monitorizar a actividade biológica do sistema modelo, a microalga Chlorella vulgaris.

O MAB transmite uma vantagem em tamanho, versatilidade e capacidade de detecção do analito multiplexada, que a torna aplicável a muitas situações de monitorização confinados, em terra ou no espaço.

Biochip Desenho e Métodos Experimentais

O biochip é de 10 x 11 mm de dimensão e tem 9 Jornadas designados como eletrodos de trabalho (EVs) e 5 eletrodos de referência de Ag / AgCl (REs). Cada eléctrodo de trabalho (WE) é de 240 m de diâmetro e são igualmente espaçados a 1,4 mm da ER, que são de 480 m de diâmetro. Estes eléctrodos são ligados às almofadas de contacto eléctrico com uma dimensão de 0,5 mm x 0,5 mm. O esquema é mostrado na Figura 2.

Voltametria cíclica (CV), e métodos de deposição galvanostáticas são utilizados para as películas electropolymerize PEDOT utilizando um BIOANALYTICal Systems Inc. (BASI) estande célula C3 (Figura 3). O contra-íon para o filme de PEDOT é adaptado para atender o íon analito de interesse. Um PEDOT com poli (estirenossulfonato) contra-ião (PEDOT / PSS) é utilizado para a H ⁺ e CO ₃ ^{2 -,} enquanto que um com sulfato de sódio (adicionado à solução como CaSO ₄₎ é utilizado para o Ca ^{2 +.} As propriedades eletroquímicas do PEDOT revestido WE é analisado usando currículos em solução redox-ativo (ou seja, 2 mM de ferricianeto de potássio (K ₃ Fe (CN) _6)). Com base no perfil de CV, análise de Randles-Sevcik foi usada para determinar a área de superfície efectiva ^10. Spin-coating a 1.500 rpm é usado para lançar ~ 2 mm de espessura membranas íon-seletivo (ISMs) sobre os eletrodos de trabalho MAB (EVs).

O MAB está contida numa câmara de célula de fluxo microfluidico cheio com um volume de 150 ul do meio de algas, as almofadas de contacto estão ligados electricamente ao sistema BASI (Fig.ure 4). A atividade fotossintética de Chlorella vulgaris é monitorado em luz ambiente e condições de pouca luz.

Protocolo

1. Preparação de Poli (3,4-etilenodioxitiofeno): Poly (sódio 4 estirenossulfonato) (PEDOT: PSS) Solution eletropolimerização de H ⁺ e CO ₃ ^{2 -} Íons

1. Adicionar 70 mg de poli (4-estirenosulfonato de sódio) (PSS Na ^{+ -)} a 10 ml de água desionizada (DI) e vórtice até estar completamente disperso (aproximadamente 10 segundos).
2. Adicionar 10.7 ul de 3,4-ethlyenedioxythiophene (EDOT) à solução em 1,1 e vortex até que a solução é completamente misturada.

2. Preparação de Poli (3,4-etilenodioxitiofeno): sulfato de cálcio (PEDOT: CaSO ₄₎ Solução eletropolimerização de íons ^{Ca2 +}

1. Adicionar 136 mg de sulfato de cálcio (CaSO ₄₎ a 10 ml de água DI e vortex, a solução não vai dispersar completamente e aparência leitosa.
2. Adicionar 10,7 EDOT mL de solução em 2.1 e vortex até ficar completamente misturado.

3. Electropolimerização do baseada PEDOTPolímeros Condutores

1. Um Bioanalytical Systems Inc. (BASI) suporte da célula C3 (figura 3) e um epsilon potenciostato / galvanostato CE são utilizados para formar a célula electroquímica para electropolimerização. Coloque a EDOT: solução electropolimerização PSS na célula electroquímica e de bolhas de azoto durante 20 minutos para remover o oxigénio dissolvido.
2. Agora cortar um platina gaze na posição contra eléctrodo da célula electroquímica. Em seguida, juntar o MAB na posição eléctrodo de trabalho da célula electroquímica com os eléctrodos de trabalho que enfrentam a platina gaze. Ajustar a profundidade MAB para que somente os eléctrodos circulares são submersas no PEDOT: PSS solução de electropolimerização. Evitar o contacto solução com as almofadas de contato elétrico quadrados.
3. Coloque uma saturada de cloreto de prata / BASI prata (Ag / AgCl) eletrodo na posição do eletrodo de referência da célula eletroquímica. Certifique-se de que o eletrodo de referência não é entre o trabalho e counteeletrodos r.
4. Para PEDOT: PSS deposição: Bolha da célula eletroquímica para 20 min, e usar o epsilon potenciostato / galvanostato CE para executar um único voltamograma cíclico de 0V - 1.1V com uma taxa de varredura de 20 mV / s em uma escala de 100 mA ±.
5. Para PEDOT: CaSO ₄ deposição: Bolha da célula eletroquímica para 20 min, e usar o epsilon potenciostato / galvanostato CE para executar cronopotenciometria a 814 nA para 30 min.

4. Voltametria cíclica de conjugados de polímeros à base de PEDOT em K ₃ Fe (CN) ₆

1. Realize os passos 3,1-3,3 acima.
2. Use o epsilon potenciostato / galvanostato CE para executar voltamogramas cíclicos único de -653 mV a 853 mV, com diferentes velocidades de varredura de (25, 50, 75, 100, l25, 150, 175, 200) mV / s em uma escala de ± 10 mA .

5. Superfície funcionalização Protocolo

1. Depósito de polímero condutivo conjugado específico para os íons de interesse, como no Passo 3.
2. Aplicar membrana íon-seletivo como no Passo 6.

6. Aplicação de membrana íon-seletivo

1. Centro da MAB no vácuo giratório chuck.
2. Depósito de 100 ul de membrana para o centro do MAB e limitada.
3. Spin-coat membrana íon-seletivo com um aplicador giram a 1.500 rpm por 30 segundos com um segundo rampa de cima e para baixo 5.
4. Aspirar o MAB spin-revestido durante 30 minutos e o chip cozer num forno a 70 ° C durante 20 min.

7. Calibração de PEDOT-PSS Polímeros Condutores Conjugado com pH e carbonato (CO ₃ ^{2 -)} membrana íon-seletivo

1. Condições do MAB durante a noite em 10 mM de bicarbonato de sódio _(NaHCO3) e 5 mM de cloreto de potássio (KCl) em meios de algas.
2. Insira o MAB no suporte de chips microfluídicos célula de fluxo.
3. Injectar 5 ml de solução de ensaio com um valor inicial de pH ou concentração (por exemplo, um pH de 4 ou 10 uM para o CO ₃ ^{2 -).} Remover bubveis de titular chip-célula de fluxo.
4. Coloque o suporte do chip-célula de fluxo para a célula de fluxo elétrico elétrica.
5. Abra o software CE epsilon e entrar no modo de potencial de circuito aberto (OP). Defina o tempo de 300 min, a escala de tensão de ± 1V, ea freqüência de corte de 10 kHz, e registrar o valor a cada 2 segundos.
6. Deixe o MAB estabilizar (procure por uma linha fixa) antes de continuar com o processo de calibração.
7. Uma vez que o MAB está estabilizado, lave a célula de fluxo com a solução teste e injetar a próxima concentração a ser calibrada (pH 5 ou 25 mM de CO ₃ ^{2 -).} Certifique-se de que não existem bolhas são autorizados a entrar na célula de fluxo. Repita os passos 7.5 e 7.6 para o pH 6, 7, 8 e 9, ou CO ₃ ^{2 -} concentrações de 50, 75, 100, 250, 500, 750, e 1.000 fiM.
8. Após a última concentração foi executado, remova o MAB e seco com ar de nitrogênio.
9. Coloque a parte de trás MAB em solução fresca condicionado até à próxima utilização.

8. Calibração de PEDOT: _CaSO4 conjugado de polímero condutor em _CaCl2

1. Condições do MAB durante a noite em 7 ml de 0,1 M de _CaCl2 e 10 fiM NaNO _3.
2. Siga os passos semelhantes aos 7,2-7,10. No passo 8.3, substituir o carbonato de solução de ensaio com uma concentração inicial de 0,01 mM de _CaCl2. Repita o procedimento para as concentrações da solução de teste de 0,05, 0,1, 0,5, 1 e 10 mm.

Resultados

Um exemplo de um resultado voltamograma cíclico (CV) de PEDOT: PSS e do seu correspondente pico de corrente catódica (I _p) versus a velocidade de varrimento (V _1/2) são mostrados nas figuras 5a e 5b, respectivamente. PEDOT: CaSO ₄ em várias taxas de varredura e sua corrente de pico catódica não são mostradas. Usando Randles-Sevcik análise ^10, as áreas de superfície efectiva do sólido contacto PEDOT: PSS e PED...

Discussão

O MAB biochip consiste assises que são construídos a partir de um ISM no topo de uma camada à base de PEDOT transdução conjugado de proteína sobre um eléctrodo de Pt, a combinação dos quais transduz a concentração iónica de interesse para um sinal eléctrico mensurável. Um potencial de eléctrodo estável é definida tanto pela camada CP e a camada ISM. Ambas as camadas também determinar o tempo de vida útil do MAB e a qualidade (ruído, desvio) do sinal eléctrico de medição.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Ethylenedioxythiophene	Sigma-Aldrich	483028
Poly(sodium 4-styrenesulfonate)	Sigma-Aldrich	243051
EC epsilon galvanostat/potentiostat	Bioanalytical Systems Inc.	e2P
Saturated Ag/AgCl reference electrode	Bioanalytical Systems Inc.	MF-2052
Pt gauze	Alfa Aesar	10283
Potassium ferricyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Potassium nitrate	J.T. Baker	3190-01
Sodium bicarbonate	Mallinckrodt/ Macron	7412-12
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S-7127
Calcium chloride	J.T. Baker	1311-01
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541
Calcium sulphate	Sigma-Aldrich	237132
C3 cell stand	Bioanalytical Systems Inc.	EF-1085
Flow-cell chip holder			Custom, courtesy of NASA Ames
Flow-cell electrical fixture			Custom, courtesy of NASA Ames
Table 2. Specific reagents and equipment.