LeafJ: um plugin ImageJ para semi-automatizado de medição forma de folha

Resumo

Demonstração de métodos fundamentais para medições folha de elevada capacidade. Estes métodos podem ser usados ​​para acelerar a folha quando se estuda a fenotipagem mutantes de muitas plantas ou plantas de outro modo de rastreio por fenótipo folha.

Resumo

Fenotipagem de alto rendimento (phenomics) é uma ferramenta poderosa para a ligação de genes para as suas funções (ver revisão ¹ e exemplos recentes ^2-4). As folhas são o órgão fotossintética primária, e seu tamanho e forma variam developmentally e ambientalmente dentro de uma planta. Por estas razões, os estudos sobre a morfologia foliar exigem a medição de vários parâmetros de muitas folhas, que é o melhor feito por ferramentas semi-automatizadas phenomics ^5,6. Sombra da copa é uma sugestão importante ambiental que afeta a arquitetura da planta e história de vida, o conjunto de respostas é coletivamente chamada de síndrome de evitar sombra (SAS) ^7. Entre as respostas SAS, sombra induzida alongamento foliar pecíolo e mudanças na área da lâmina são particularmente úteis como índices ^8. Até à data, os programas de folha de forma (por exemplo, forma ^9, LAMINA ^10, LeafAnalyzer ^11, LEAFPROCESSOR ¹²⁾ pode medir contornos folha e categorizar formas de folha, Mas não pode emitir comprimento do pecíolo. A falta de sistemas de larga escala de medição de pecíolos tem inibido abordagens phenomics a SAS pesquisa. Neste artigo, descreve um recém-desenvolvido plugin do ImageJ, chamado LeafJ, que pode rapidamente medir o comprimento do pecíolo e parâmetros do limbo foliar da planta modelo Arabidopsis thaliana. Para a folha ocasional que a correção manual do limite exigido lâmina pecíolo / folha foi utilizado um tablet touch-screen. Além disso, a forma de folha celular e número de células da folha são determinantes importantes do tamanho da folha ^13. Separado LeafJ apresentamos também um protocolo para a utilização de um tablet com tela de toque para medir a forma da célula, área e tamanho. O nosso sistema de medição de folha característica não está limitada a sombra esquiva pesquisa e acelerará a fenotipagem folha de muitos mutantes e plantas de triagem por fenotipagem folha.

Protocolo

1. Materiais vegetais

Note-se que este protocolo visa o crescimento da planta para a detecção de resposta de esquiva sombra. Você pode crescer plantas em seu estado preferido.

1. Polvilhe sementes de Arabidopsis thaliana na água papel de filtro embebido em 9 centímetros pratos de Petri e loja (estratificar)-los a 4 ° C por quatro dias no escuro.
2. Transferir essas placas de Petri para condições de sol simulados: 80-100 μE radiação fotossinteticamente ativa (PAR) e vermelho-distante suplemento para levar o R: relação FR para 1,86. Usar condições de dia longo (16 horas luz / escuro de 8 h) e temperatura constante de 22 ° C. Incubar nesta condição durante três dias, para permitir que as sementes germinem.
3. Transfira semente germinou para o solo e manter as plantas sob condições de dom Para experiências em grande escala, recomendamos a preparar pequenas etiquetas para etiquetar cada plantas usando Data Merge Manager no Microsoft Word 2004 (ou posterior) para fazer etiquetas.
4. Onze dias após a transfer ao solo, mover metade das plantas à condição de sombra: o mesmo que sol, mas com a luz vermelha distante suplementar para que o rácio R / FR para 0,52.
5. Depois de um período adicional de 12 dias, as plantas estão prontas para imagiologia folha. Nesta fase, as folhas mais velhas têm totalmente amadurecido enquanto as folhas mais jovens estão ainda em expansão, de modo que você capturar um instantâneo do desenvolvimento. Você pode querer escolher um tempo de desenvolvimento diferente dependendo de suas necessidades.

2. Captura de Imagens Folha dissecados

1. Prepare folhas de transparência marcados com genótipo da planta e condição de crescimento, com cinco quadros retangulares. Um quadro corresponde às folhas de uma planta. Microsoft Excel pode ser usado para imprimir uma grelha de acordo com as etiquetas.
2. Dissecar folhas de 26 dias as plantas antigas.
3. Digitalização deixa a 600 dpi em um scanner plano. Note-se que folhas de uma planta devem ser colocadas na vertical no interior de uma janela a preto em um sanduíche de folhas transparentes. Evite tocar em folhaspara um caixilho de janela e as folhas de cor preta que se sobrepõem, o que dará erros nos procedimentos que se seguem.

3. Análise Folha Imagem por LeafJ

1. Download ImageJ Arraste o arquivo LeafJ.jar para a pasta plugins do ImageJ.
2. Abrir um arquivo de imagem em ImageJ 1.45s ou mais tarde ^14.
3. Dividir a imagem em três cores canais (vermelho, verde e azul) por "Cor> Imagem de Canais> Split" e aplicar limite para a imagem do canal de azul.
4. Seleccionar todas as folhas de uma planta de uma ferramenta retângulo (Figura 1A).
5. Selecione "LeafJ" do menu de plugin.
6. Selecione informações de anotação para esta planta a partir da caixa de diálogo que aparece. Você podeeditar os valores padrão que aparecem aqui, clicando em "editar essas opções".
7. Após a execução do plugin LeafJ e antes de clicar no botão "OK", editar linhas traçadas a partir da região de interesse janela do gerenciador (ROI) (se necessário; Figura 1B). Um tablet com tela de toque (como um iPad) é útil para este procedimento. iPads pode ser ligado a um computador, como um monitor externo usando software Air Display.
8. Exportar resultados de medição e informações associadas (nomes de arquivos, tempo de floração, dissecados, medidos por, etc) para o Microsoft Excel ou software equivalente.

4. Folha de Análise de Imagem celular em ImageJ

1. Fix dissecados folhas tal como descrito na referência ¹⁵ após a digitalização (passo 2). FAA folhas fixas podem ser mantidos em 4 ° C durante pelo menos 6 meses.
2. Limpar as folhas mudando fixador FAA para solução de hidrato de cloral e folhas incubar por 1 a 2 horas antes de observação microscópica ^15.
3. Monte sai em milhascroscope desliza com tricomas voltado para cima. Usando ampliação de 40x em um composto, uma camada de imagem de microscópio mesofilo do centro de cada folha em ambos os lados da nervura principal, evitando células próximas tricomas ou veias.
4. Traço célula folha esboça por ImageJ ferramenta de gerenciamento de ROI com auxílio do tablet com tela de toque e uma caneta (como descrito no passo 3). Análise de imagens de células usa os recursos integrados do ImageJ, mas não exige LeafJ.

Resultados

1. Imagens de folha mostrando Estimativas do pecíolo e limite de folhas, e sua janela de medição

Um dos recursos mais úteis do LeafJ é a detecção automática de fronteira lâmina foliar / pecíolo (Figura 1). O algoritmo LeafJ funciona da seguinte maneira: o embutido ImageJ funcionalidade ParticleAnalyzer é usado para localizar e determinar a orientação das folhas dentro da selecção do utilizador. Para cada folha a largura da folha é determinada ao longo de todo o ...

Discussão

Nosso "LeafJ" plugin permite a medição do comprimento do pecíolo semi-automaticamente, aumentando o rendimento quase seis vezes medição manual. Comprimento do pecíolo é um índice importante da SAS e também é um marco de outros fenômenos, como a resistência submersão e crescimento hyponastic ^17. Por conseguinte, este encaixe pode ser útil para uma vasta gama de pesquisadores de plantas.

Nosso plugin é implementado em uma bem estabelecida de software baseado...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
vermelho-distante luz LED	Orbitec	feitos
transparência	IKON	HSCA / 5
digitalizador	Epson	Epson Perfection V700 PHOTO
Image J	NIH		http://rsbweb.nih.gov/ij/
LeafJ	personalizado		http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab
Air Display	Avatron Software Inc.		em branco "http://avatron.com/>
iPad2	Apple Inc.		http://www.apple.com/