Molécula única imagem da regulação gênica<em&gt; Em vivo</em&gt; Uso de ativação Cotranslational por clivagem (CoTrAC)

Resumo

Descreve-se um método de fluorescência microscopia, Activation Co-translacional pela clivagem (CoTrAC), a imagem a produção de moléculas de proteína de células vivas com uma única molécula de precisão, sem perturbar a funcionalidade da proteína. Este método tem sido utilizado para seguir as dinâmicas de expressão estocásticos de um factor de transcrição, o repressor CI λ ¹.

Resumo

Descreve-se um método de fluorescência microscopia, Activation Co-translacional pela clivagem (CoTrAC) a imagem a produção de moléculas de proteína de células vivas com uma única molécula de precisão, sem perturbar a funcionalidade da proteína. Este método faz com que seja possível contar o número de moléculas de proteínas produzidas em uma célula durante sequenciais, as janelas de tempo de cinco minutos. Ela requer um microscópio de fluorescência com o laser de densidade de potência de excitação de ~ 0,5-1 kW / cm ^2, o que é suficientemente sensível para detectar moléculas individuais de proteínas fluorescentes em células vivas. O repórter fluorescente usada neste método consiste em três partes: uma sequência de membrana alvo, um amadurecimento rápido, proteína fluorescente amarela e uma sequência de reconhecimento de protease. O repórter é traducionalmente fundidas com o N-terminal de uma proteína de interesse. As células são cultivadas em um estágio de microscópio de temperatura controlada. De cinco em cinco minutos, moléculas fluorescentes no interior das células são criadas imagens (e mais tarde coUnted, analisando imagens de fluorescência) e, posteriormente, Foto-descoloração, de modo que apenas as proteínas recém-convertidos são contados na medição seguinte.

Imagens de fluorescência resultantes deste método podem ser analisados ​​por detecção de manchas fluorescentes em cada imagem, atribuindo-lhes a células individuais e, em seguida, a atribuição de células de linhagens de células. O número de proteínas produzidas dentro de uma janela de tempo numa dada célula é calculado dividindo-se a intensidade de fluorescência das manchas integrada com a intensidade média de moléculas fluorescentes individuais. Foi utilizado este método para medir os níveis de expressão na gama de 0-45 moléculas individuais em janelas de tempo 5 min. Este método permitiu-nos medir o ruído na expressão do repressor λ CI, e tem muitas outras aplicações potenciais em sistemas de biologia.

Protocolo

1. Fluxo de Trabalho de Engenharia tensão

1. Inserir as sequências de codificação (a) uma sequência de localização da membrana, (b) uma proteína fluorescente amadurecimento rápido e (c) uma sequência de reconhecimento de protease N-terminal e para a armação com uma proteína de interesse (por exemplo, um factor de transcrição). Utilizou-se a membrana alvo Tsr-Venus repórter ² e fundiu-o para a sequência de reconhecimento da protease de Ubiquitina (Ub) para contar o número de moléculas expressas bacteriófagos λ proteína repressora CI. Detalhes sobre como se construídas a proteína de fusão Tsr-Venus-Ub-CI, em substituição do tipo selvagem CI região codificante e que incorpora o arquétipo na E. cromossoma coli utilizando λ recombinação Red ^3, estão descritos em detalhe na ref. 1.
2. Verifique se todas as modificações por seqüenciamento.
3. Transformar um plasmídeo que codifica uma protease específica para a sequência de reconhecimento usado acima para uma estirpe que expressa o repórter fluorescente e proteína de interesseem fusão traducional. Utilizou-se a protease Ubp1, que cliva imediatamente a seguir ao resíduo C-terminal da ubiquitina ^4.

2. As células de cultura e preparar a amostra

1. Escolha um E. coli colónia de interesse a partir de uma placa de agar de fresco listado em 1 ml M9 meio mínimo suplementado com ⁵ 1X ácidos aminados do MAM e antibióticos apropriados. Incubar num agitador à temperatura desejada por tempo suficiente para alcançar OD _600> 1.0 (densidade óptica a 600 nm).
2. Dilui-se a cultura em um meio M9 ml fresco com os antibióticos apropriados para a = 0,02 OD _600. Incubar num agitador à temperatura apropriada. Densidade celular inicial pode ser aumentada, se necessário para a baixa temperatura de crescimento.
3. Quando o OD ₆₀₀ = 0,2-0,3 (a 37 ° C, com uma cultura inicial de células de _DO600 = 0,02, isso vai levar 3-4 horas), iniciar a preparação do gel de agarose a almofada (passo 3).
4. As células estão prontas para imagiologia quando OD _{600 = 0,3-0,4.}
5. Transferir 1 ml da cultura incubada num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, de centrifugação a 10000 xg durante 1 minuto numa microcentrífuga de bancada.
6. Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio fresco M9 e ressuspender o pellet cuidadosamente.
7. Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min.
8. Repita o passo 1,6 e 1,7. Descartar o sobrenadante.
9. Delicadamente ressuspender em 1 ml M9 mídia. As células podem ser directamente utilizados para imagiologia de microscópio ou 10 diluída - a 100 vezes para assegurar densidades celulares baixas para imagiologia timelapse. Note-se que as densidades celulares baixas são importantes para a imagiologia timelapse estendida. A câmara de imagem (passo 4) é vedada durante a experiência. Devido ao crescimento exponencial de células, as concentrações de células iniciais elevadas podem reduzir significativamente o oxigénio no interior da câmara após crescimento prolongado na almofada de gel, reduzindo a maturação da proteína fluorescente e que afectam o crescimento das células.

3. Preparar a solução de agarose

1. Pesar 10-20 mgbaixo ponto de fusão à temperatura de agarose para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Adicionar adequado volume médio mínimo M9 sem antibióticos para fazer uma solução de 3% de agarose.
3. Aquece-se a solução de agarose durante 30 min a 70 ° C para derreter, invertendo o tubo para assegurar que a solução é completamente fundida e homogénea. A almofada de gel pode ser vertido neste ponto (passo 4), ou a temperatura pode ser reduzida para 50 ° C e mantida durante várias horas para uso posterior.

4. Prepare Pad Gel na Câmara

1. Cerca de 50 min antes da imagiologia, lavar uma corrediça Microaqueduct com água.
2. Lavar uma cobertura de vidro limpas (usando um método rigoroso de limpeza como o descrito no ponto ⁶⁾ e Microaqueduct lâmina com água estéril e seco por sopragem com ar comprimido.
3. Coloque a junta de borracha na corrediça Microaqueduct modo que cubra as entradas e saídas do lado da lâmina de vidro Microaqueduct (este pode ser modificado para aplicações emque a mídia é perfundido através da amostra). Aplicar 50 ul de solução de agarose (passo 3) para o centro da lâmina Microaqueduct.
4. Topo da solução de agarose com a tampa de vidro limpo, seco.
5. Deixar a solução de agarose mantida à temperatura ambiente durante 30 min.
6. Enquanto isso, a preparar uma amostra de células (passo 2).
7. Retire cuidadosamente o vidro de cobertura da parte superior da almofada de gel. Adicionar 1,0 uL de cultura de células lavadas a parte superior da almofada de gel. Espere por ~ 2 min para a cultura a ser absorvido pela almofada de gel. É importante não esperar tanto tempo que os overdries almofada de gel, mas tempo suficiente para que as células estão devidamente aderiu à almofada de gel. O tempo ideal de espera vai variar com a temperatura e umidade.
8. Enquanto espera, secar outra tampa de vidro previamente limpas.
9. Cobrir a amostra com a tampa de vidro novo assegurando que a tampa de vidro deslizante e Microaqueduct estão bem alinhados.
10. Montar a temperatura da câmara de crescimento controlado seguindo as instruções do fabricante.Pode agora ser usado para imagens com microscópio (passo 5).

5. Imagem e Aquisição de Filmes Timelapse

1. Ligar o laser e microscópio seguindo as instruções do fabricante (por exemplo, o laser pode precisar aquecido para ~ 0,5 h antes da experiência).
2. Bloquear a câmara montada na fase de inserção no microscópio. Definir a temperatura da câmara de crescimento e o aquecedor objectivo, a 37 ° C ou a temperatura de crescimento desejado outro.
3. Se imaging acima da temperatura ambiente, o foco ou almofada de gel, normalmente deriva significativamente para ~ 15 min após a mudança de temperatura inicial. Na prática, usar este tempo para encontrar regiões de interesse e modificar os scripts de imagem como necessário para uma experiência.
4. Encontrar as células no microscópio e armazenar a posição de cada célula após centrando-o dentro de uma região de imagem pré-definidos e alinhados. Mais do que uma célula pode ser trabalhada em cada janela de tempo de aquisição de imagem. Para timelapse imagens sobre mquaisquer gerações, assegurar que as células são inicialmente separadas imaged de outras células por pelo menos algumas centenas de ^ M, de modo que outras colónias não irá entrar na região de imagem durante o crescimento.
5. Ajustar a intensidade da excitação com laser, de modo que quase toda a Fotobranqueador moléculas fluorescentes dentro de 6 posições (Figura 5).
6. Usando um script de imagem automatizado / jornal, adquirir dados timelapse utilizando o algoritmo descrito no fluxo de trabalho experimental na Figura 3.

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Resultados

Os resultados típicos de uma experiência CoTrAC rastrear a produção do repressor λ CI são mostrados nas Figuras 4 e 5. Nesta experiência, foram obtidas imagens de 12 colónias em intervalos de 5 min. Em cada ponto de tempo, a colónia foi autofocused, centralizado no interior da região da imagem latente. Em seguida, a posição centrada / foco foi armazenada e uma imagem de campo claro foi adquirido. O palco foi então translocado por ~ 0,5 m ao longo do eixo z para mover a part...

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Discussão

O método CoTrAC pode ser generalizado para medir a produção de outras proteínas em que N-ou C-terminais convencionais fusões de proteínas fluorescentes podem comprometer a actividade da proteína. A estratégia CoTrAC tem três vantagens únicas sobre os métodos correntes. Em primeiro lugar, co-traducional fusão assegura que uma molécula do repórter fluorescente é produzido para cada molécula da proteína de interesse, permitindo a contagem precisa da produção de proteína em tempo real. Em segundo lugar, ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Agarose (temperatura de fusão baixa)	Lonza	50100
Milli-Q H 2 O
5 × sais M9			Seguinte receita descrita em 9
Glicose 20%
MgSO4
CaCl 2
50 x solução de MEM aminoácidos	Invitrogen	11130-051
Temperatura controlada CrescimentoCâmara Adaptador de estágio	Bioptechs	FCS-2
Aquecedor objetivo	Bioptechs	Modelo depende objetiva de microscópio
Deslize Microaqueduct	Bioptechs	130119-5
Micro óculos cobertura	VWR	40CIR-1	Pode ser difícil de fonte; também disponível a partir de Bioptechs
Tampa de vidro / slide junta	Bioptechs	FCS2 0,75 mm
Microscópio de fluorescência	Vário	Exemplo de configuração: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, microscópio Olympus IX-81, Olympus PlanApo 100X 1,45 NA objetivo, Metamorph software	Deve ter excitação laser, automatizado fase xyz, software de automação capaz de imagem roteirizado e autofocus, óptica capazes de resolvinag únicas proteínas fluorescentes
EM-CCD da câmera	Vário	Exemplo de configuração: Andor ixon DU-898	Deve ter ruído suficientemente baixo para detectar proteínas fluorescentes individuais acima fundo