Procedimento para decelularização do Coração Suínos por perfusão coronariana retrógrada

Resumo

Um método para rápida e completamente remover componentes celulares a partir de um coração porcino intacta através da perfusão retrógrada é descrito. Este método produz um sítio específico cardíaco matriz extracelular andaime que tem o potencial para uso em várias aplicações clínicas.

Resumo

Perfusão baseado descelularização órgão inteiro recentemente ganhou interesse no campo da engenharia de tecidos, como um meio de criar locais específicos andaimes de matriz extracelular, enquanto que em grande parte preservando a arquitectura nativa do andaime. Até à data, esta abordagem tem sido utilizada para uma variedade de sistemas de órgãos, incluindo o coração, pulmão, fígado e ^1-5. Métodos anteriores para a descelularização de tecidos, sem uma rede de fácil acesso vascular têm contado após a exposição prolongada do tecido a soluções de detergentes, ácidos, ou tratamentos enzimáticos, como um meio para remover os componentes celulares e nucleares a partir do ambiente circundante extracelular ^6-8. No entanto, a eficácia destes métodos articulada sobre a capacidade das soluções para permear o tecido por meio de difusão. Em contraste, a perfusão de órgãos por meio do sistema natural vascular reduzido eficazmente a distância de difusão e transporte facilitado de decellularizatiem agentes para o tecido e os componentes celulares para fora do tecido. Aqui, nós descrevemos um método para a plena decellularize um coração suíno intacta através de perfusão coronariana retrógrada. O protocolo produziu uma totalmente descelularizado cardíaca matriz extracelular (ECM-c) de andaime com a estrutura tridimensional do coração intacto. O nosso método de uso de uma série de enzimas, ácidos e detergentes, juntamente com enxaguamentos hipertónicas e hipotónico para ajudar na remoção e lise de células. O protocolo utilizado uma solução de Tripsina a separar as células da matriz seguido de soluções de Triton X-100 e desoxicolato de sódio para ajudar na remoção do material celular. O protocolo descrito também utiliza velocidades de perfusão superiores a 2 L / min, por períodos de tempo prolongados. A taxa de fluxo elevada, juntamente com a solução muda de agentes de transporte autorizados para o tecido, sem contaminação de detritos celulares e eficaz assegurada a lavagem do tecido. O método descrito removido todo o material nuclear da native tecido cardíaco porcino, criando um local específico cardíaco ECM andaime que pode ser utilizado para uma variedade de aplicações.

Protocolo

1. Preparação de tecidos e Experimento Setup

1. Colheita de órgãos suínos imediatamente após a eutanásia de um abatedouro ou de pesquisa e enxaguar o excesso de sangue. Aparar o coração do excesso de gordura e de tecido, mantendo os átrios e aorta intacta. Aparar a gordura para separar a artéria pulmonar da aorta. Se houver quaisquer cortes no tecido, descartar adequadamente.
2. Enrole cada coração individualmente em papel freezer e armazenar todo o tecido em um congelador -80 ° C durante pelo menos 24 horas para garantir a congelação completa.
3. Quando pronto para uso (geralmente menos do que 3 meses), descongelar um coração porcino intacto congelado em água do tipo 1 durante a noite submersa num copo de L 4 a 4 ° C.
4. Depois que o coração está completamente descongelado, pat o coração seco, pesar no coração, e registrar o peso. O coração de um porco peso de mercado deve pesar cerca de 375-450 g.
5. Ligue tamanho 18 tubulação Masterflex a ¼ final "de um redutor de farpado. Insira o redutor farpado etubo no interior da aorta. Braçadeiras de mangueira coloque 2 ou laços zip seguras ao redor da aorta, logo abaixo do tronco braquiocefálico. O redutor e tubo deve permanecer acima da válvula da aorta, para as artérias coronárias podem ser perfundidos (Figura 1).
6. Use uma seringa de 30 ou 60 ml para encher o tubo com água Tipo I. Inserir o tubo no interior do cartucho de uma bomba Masterflex rolo no seu ponto médio aproximado. Submerge final do fluxo de entrada da tubagem no fundo de um copo de L 4 preenchido com 2,5 L de água e fixar o tubo.
7. Colocar o coração no copo cheio de água, e a bomba principal para remover bolhas de ar. Se forem observadas bolhas provenientes da aorta onde o tubo é inserido, a aorta pode precisar de ser reposicionada ou protegido com laços adicionais. Uma vedação estanque ao ar é importante para manter a pressão adequada durante o processo de descelularização (Figura 2).
8. Colocar o copo L 4 contendo 3 L de uma 0,2% NaN Trypsin/0.05% EDTA/0.05%3 Solução de agitar placa e aquecê-la a 37 ° C em preparação para o processo de descelulação.

2. Lava tecido

1. Definir a bomba a uma taxa de fluxo de 400 ml / min, assegurando que a dimensão da mangueira correcto está seleccionado. Lave o coração com água tipo I para 15-25 min. Como a bomba é iniciado, o coração deve inchar e derramar o sangue dos ventrículos. Solução fresca deve ser substituído a cada 5-10 minutos, ou conforme necessário, com base na quantidade de sangue removido a partir do coração. Se o sangue não é emanada a partir do coração, ajustar o tubo e as braçadeiras conforme necessário.
2. Parar a bomba e transferir o coração para uma proveta separada cheio com Solução Salina Tamponada com Fosfato 2X (PBS). Depois o tubo é imerso em solução, o arranque da bomba e aumentar a taxa de fluxo de 700 ml / min. O coração deve permanecer em solução durante 15 minutos, a mudança da solução a cada 5 min. Cada alteração solução requer que a bomba seja interrompido temporariamente, enquanto o tecido e tubo é movidopara o copo de novo.
3. Transferir o coração ao Tipo I de água durante 10 minutos e aumentar a taxa de fluxo de 750 ml / min.

3. Perfusão decelularização e solução

1. Transferir o coração ao copo contendo 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% _NaN3 a 37 ° C. Aumentar a velocidade da bomba de 1200 ml / min e ligar a bomba. Use uma barra de agitação colocados na parte inferior do copo para fazer circular solução no copo. O coração deve permanecer na Trypsin/0.05% EDTA/0.05% 0,2% _NaN3 solução a 37 ° C durante um total de três horas. Depois de 1 hora, aumentar a velocidade da bomba de 1500 ml / min. Depois de uma hora adicional, aumentar a velocidade da bomba de 1800 ml / min. O tecido é sujeito a lentamente velocidades de perfusão aumentado para condicionar os tecidos e prevenir a ruptura dos vasos. O coração vai inchar e quase o dobro em tamanho durante esta etapa do protocolo. O tecido vai perder a sua cor natural, progredindo a partir do átrio para o ápice durante todo diae protocolo (Figura 3).
2. Depois de cada solução de perfusão, de um de dois passos lavagem é realizada para remover os restos celulares, resíduos químicos, e a lise das células de ajuda. Cada lavagem é constituída por uma lavagem de 10 min em água de Tipo I, seguido por uma lavagem de 10 min com 2X solução de PBS à temperatura ambiente. Cada lavagem consiste na remoção da solução a partir do recipiente original, a adição de soluções de lavagem, e fazer circular o perfusato no copo contendo o coração submerso. Após a 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% _NaN3 solução de água, perfundir a 1.900 ml / min e, em seguida, perfundir 2X PBS a 1950 ml / min.
3. Transferir o coração para uma solução de 3% de Triton% X-100/0.05 EDTA/0.05% _NaN3 à temperatura ambiente. Aumentar a velocidade da bomba de 2000 ml / min e uma solução de perfundir durante uma hora. Remover a solução a partir do recipiente e substituir com solução fresca, aumentar a velocidade da bomba a 2100 ml / min, e perfundir a solução fresca durante mais uma hora e meia, trazendo o tempo total em3% de Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN _3-2,5 h.
4. Enxaguar o tecido em água do tipo I em 2150 ml / min e em PBS 2x 2180 ml / min, durante 10 min cada.
5. Transferir o coração para uma solução de desoxicolato de sódio a 4%, à temperatura ambiente. Aumentar a velocidade da bomba de 2200 ml / min e uma solução de perfundir durante 3 hr.
6. Enxaguar o tecido em água e de tipo I em 2X PBS a 2200 ml / min durante 15 minutos cada, depois de alterar as soluções de 5-10 min para cada solução. Os passos descritos de perfusão pode ser dividida em vários dias por realizar a etapa de lavagem duas vezes e armazenando o coração com tubagem ligado durante a noite a 4 ° C e submersos em água do tipo I.
7. No dia seguinte, executar a 5 minutos, lavar com água de Tipo I, a 750 ml / min, seguida por uma lavagem de 5 minutos em PBS 1X a 1,500 ml / min. O protocolo pode então ser continuada a uma taxa de fluxo descrito na solução apropriada.

4. Desinfecção e Processamento Final

1. Transferir o coração a uma perac 0,1%ácido etic / solução de etanol a 4% e solução perfundir durante 1,5 horas a 2200 ml / min.
2. As enxaguaduras finais para o tecido são todos realizados a 2.200 ml / min. Perfundir o tecido com 1X PBS durante 15 min, seguido por duas lavagens de 5 min em água de tipo I. Esta série de lavagens é repetido mais uma vez, a fim de completar o procedimento de perfusão de solução.
3. Desligar a bomba e retirar o coração da solução para drenar o coração. Cortar os laços da aorta, remover todos os tubos, e colocar o coração em um copo vazio para drenar durante 1 h. O excesso de líquido terá de ser drenado periodicamente. Deite o coração de uma almofada absorvente para drenar completamente o coração (Figura 4).
4. Depois de a maior parte da água é removida, registrar o peso da matriz extracelular cardíaca (C-ECM). O coração pode ser esperado para perder cerca de 20-25% do seu peso inicial, durante o processo de descelulação.
5. Dissecar os ventrículos direito e esquerdo, bem como do septo ventricular para DNA quantificatie no processamento histológico, a fim de confirmar a descelularização completa do tecido (Figura 5).
6. Congele o C-ECM a -80 ° C durante pelo menos 2 horas antes da liofilização.

Resultados

O efeito da descelularização sobre corações porcinos inteiros naturalmente varia devido a diferenças no tamanho, pressões e arranjo do vaso. Portanto, a composição exacta dos derivados scaffolds da matriz extracelular não será o mesmo de coração para coração. A realização do protocolo descrito produzirá um coração que parece branca ou translúcida, o que indica a perda de material celular. No entanto, é geralmente aceite que um tecido, pode ser considerado como "descelularizado" com base na...

Discussão

O presente estudo descreve a metodologia para a descelularização consistente e eficaz de um coração porcino. O protocolo foi uma modificação de um relatório publicado anteriormente ^1, e inclui uma exposição mais longa ao fluxo e pressão elevada, o que proporcionou resultados mais reprodutíveis. O tecido resultante descelularizado atendeu a todos os critérios publicados para a descelularização sucesso de tecido ^2. Solução muda frequentes foram realizadas para limitar a reintrodução...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente / Material	Companhia	Número de Catálogo	Comentários
Tripsina	Gibco	15090
EDTA	Pescador	BP120-500
NaN3	Sigma	S2002-500G
Triton X-100	Sigma	X100-1L
PBS 10X	Pescador	BP399-20
Deoxicolato de sódio	Sigma	D6750-500G
Ácido Peracético	Pfaltz e Bauer	P05020	35% CAS # 79-21-0
Etanol	Pharmco	111000200
Masterflex bomba de acionamento	Cole Parmer	SI-07524-50
Tubulação Masterflex	Cole Parmer	96400-18	Tamanho 18
Redutor farpado	Cole Parmer	EW-30612-20
Beaker 4L	Fisher Scientific	02-540T