Visualização de mRNAs retículo endoplasmático localizados em células de mamíferos

Resumo

Descrevemos aqui um método para visualizar retículo endoplasmático associadas mRNAs em células de cultura de mamífero de tecidos. Esta técnica envolve a permeabilização selectiva da membrana plasmática com digitonina para remover conteúdo citoplasmático seguido fluorescente In situ Hibridação para detectar ou poli granel (A) mRNA ou transcritos específicos.

Resumo

Nos eucariotas, a maioria dos RNAs mensageiros (mRNAs), que codificam proteínas de membrana e segregadas são localizados na superfície do retículo endoplasmático (ER). No entanto, a visualização destes mRNAs pode ser um desafio. Isto é especialmente verdadeiro quando apenas uma fracção do mRNA é ER-associado e a sua distribuição a esta organela é obstruída por não-segmentados (isto é, "livre") transcrições. A fim de controlar ER-associados mRNAs, foi desenvolvido um método no qual as células são tratadas com uma exposição de curta duração a uma solução de extracção que digitonina permeabilizes selectivamente a membrana do plasma e, portanto, remove o conteúdo citoplasmático, mantendo simultaneamente a integridade do ER . Quando este método é acoplado com hibridação in situ fluorescente (FISH), pode-se visualizar claramente ER-bound mRNAs por microscopia de fluorescência. Usando este protocolo o grau de ER-associação, quer para a granel de poli (A) ou transcritos de ARNm específicos podem ser avaliadose ainda quantificado. No processo, pode-se utilizar este teste para investigar a natureza do mRNA do ER-interacções.

Introdução

Nos eucariotas, a codificação de mRNA e proteínas da membrana secretada pode ser orientada para o ER por co-tradução do sinal de reconhecimento ^1,2 partícula e pode ser mantido no ER via das interacções directas entre os ribossomas e translocons durante a tradução ^3,4. No entanto, se mRNAs podem ser direcionados e mantido na ER independente de ou ribossomos ou a tradução não estava claro até muito recentemente. Estudos anteriores tentaram abordar se há tradução independente de associação com o mRNA ER utilizando técnicas de fraccionamento celular. Como as condições químicas severas eram necessárias para desassociar ribossomos de ER vesículas derivados, que podem interromper o potencialmente delicado mRNA-ER associação, esses estudos não foram conclusivos, fornecendo provas para ^5-8 e contra ^9,10 ribossomal independente de ancoragem de mRNA para o pronto-socorro .

Para contornar estes problemas, desenvolvemos um protocol para isolar e imagem ER ligados mRNAs. Este procedimento envolve um tratamento de extracção suave, que remove eficazmente todo o conteúdo citoplasmático da célula (incluindo os não-ligado ER mRNAs), ao mesmo tempo preservando a morfologia ER e todas as suas moléculas associadas. Usando este protocolo, demonstramos que um subconjunto de mRNAs são orientados e, em seguida, mantido na ER independentemente de ribossomas ou de tradução ^11.

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Protocolo

1. Preparação de Materiais para extracção

1. Preparação de Células
   1. Semente células de cultura de tecidos tratados com ácido sobre lamelas durante pelo menos um dia antes da experiência. Usamos COS-7 ou U2OS, como estas duas linhas de células exibem robusta de produção de proteína segregada e tem um ER bem definida. Note-se que para obter a eficiência de extracção elevado, as células não deve exceder 80% de confluência no lamela no dia da experiência.
   2. Se um mRNA específico exógeno está a ser investigada, as células são transfectadas um dia após a sementeira com plasmídeos contendo o gene de interesse, utilizando protocolos de transfecção convencionais. As células são então deixadas a expressar o mRNA durante pelo menos 18 horas antes da extracção.
2. Tratamento das células com inibidores de tradução
   1. Para testar o efeito de ribossomas intactas na manutenção de mRNAs associação com o ER, as células podem ser tratadas com inibidores de tradução que perturbam a associaçãode ribossomas com o ARNm ^11.
   2. Inibidores de iniciação da tradução, tais como homoharringtonin (HHT), pactamycin, ou 2 - (4-metil-2 ,6-dinitroanilino) - N-metilpropionamida (MDMP), evitar novas ribossomas de se associar com a transcrição enquanto simultaneamente permite a ribossomas envolvidos completar tradução ^12-14. Uma vez que a taxa de conversão para a maioria das proteínas em células de mamífero é de 5 aminoácidos por segundo, independentemente do comprimento ou da utilização de codões de RNAm ^15, um tratamento de 30 min deve limpar ribossomas fora de mensagens com grelhas de leitura abertas, enquanto 27.000 nucleótidos (que codifica para as proteínas contanto que 9000 aminoácidos).
   3. Inibidores tais como a puromicina promover a expulsão prematura da cadeia nascente e, portanto, perturbar polissomas ^12. No entanto, para interromper completamente a associação dos ribossomas puromicina-tratados com o mRNA, agentes quelantes tais como EDTA de magnésio tem de ser adicionada à extracção digitonina ¹¹ buffer.
   4. Neste ensaio, as células são tratadas com 200 uM de puromicina, 5 HHT uM, ou meio de controlo, durante 30 minutos antes da extracção.
3. Preparação de digitonina tampão de extração. Para visualizar ER-localizadas mRNAs sem obstrução da livre (isto é, não-citoplasmáticos ER-associados) transcritos, que selectivamente permeabilizar as células com digitonina, um glicósido esteróide que interage preferencialmente com 3β-hydroxysterols. Em baixas concentrações, digitonina permeabilizes selectivamente porções da membrana de plasma, fazendo com que 'leakiness' ^16. Em contraste, a membrana do RE e do envelope nuclear, que é pobre em colesterol, são deixadas intactas ^16,17.
   1. Digitonina pó (Sigma Aldrich) é dissolvido em água destilada a 5% peso / volume, e esta solução estoque é separado em alíquotas para pequenos volumes e armazenado a -20 ° C. Na nossa experiência, múltiplos ciclos de congelação-descongelação diminui a eficiência da digitonina dissolvido.
   2. Uma solução de estoque deCHO tampão 10x (1x concentração da solução de trabalho: 115 mM de KAc, HEPES 25 mM pH 7,4, 2,5 mM MgCl _2, 2 mM EGTA e 150 mM de sacarose) é preparado com RNase-free reagentes e armazenado a -20 ° C. A solução de trabalho (1x tampão CHO) é preparada por diluição da solução de reserva com RNase isento de água e pode ser armazenado a 4 ° C.

2. Extração digitonina

1. Preparar soluções de extracção
   1. Um bloco de aquecimento com uma superfície plana, é pré-aquecida a 40 ° C e mantida a esta temperatura durante a extracção.
   2. Para formar uma superfície de trabalho plana, que é livre de RNase, o bloco de aquecimento é humedecido com um pouco de água e revestida com um novo pedaço de Parafilm M (Bemis Company, Inc). As bolhas de ar entre a folha de parafilme e do bloco de aquecimento estão suavizados utilizando RNase livre de luvas e kimwipes (VWR).
   3. 1x CHO tampão é aquecido a 37 ° C por incubação num banho de água.
   4. Placas de 6 poços são usadas para lavare corrigir as células. Cada linha de 3 poços é usado para uma tampa deslizante. Para os dois primeiros poços na fila, 2 ml de tampão de CHO aquecido é adicionado. Para o bem último, 2 ml de solução de fixação (PBS paraformaldeído a 4%, + (microscópio electrónico Sciences)) é adicionado. Este tabuleiro pode ser armazenado na incubadora a 37 ° C até que as células estão prontas para a extracção.
   5. Digitonina solução de extracção é preparada por diluição da solução estoque digitonina a 0,025% com tampão de CHO quente, imediatamente antes de usar. Novamente, note que para células tratadas com puromicina, o tampão de extracção deve conter, adicionalmente, 20 mM de EDTA a perturbar eficientemente ribossomas ^11. Gotas de 100 ul da solução de extracção, são colocados no bloco de aquecimento parafilme coberta imediatamente antes da extracção.
2. Extracção digitonina e fixação das células
   1. Remover as células da incubadora a 37 ° C.
   2. Durante o processo de extracção, lamelas são manipulados com a ajuda de uma pinça de joalheiro. Coma pinça pegar a lamela e mergulhá-lo no buffer primeiro e depois o segundo poço contendo CHO para lavar do meio de crescimento.
   3. Rapidamente blot o tampão em excesso para fora do lado de trás da lamela com um Kimwipe e colocar imediatamente a lamela lateral da célula, virado para baixo, sobre a solução de extracção.
   4. Depois de 10 segundos, pegar a lamela com a pinça e imediatamente transferi-lo, lado da célula para cima, para o bem contendo tampão de fixação de 4% paraformaldeído.
   5. Deixe que a amostra incubar em fixador durante pelo menos 15 min à temperatura ambiente.
3. Preparação de células de controlo não extraído. Para determinar a quantidade total de mRNA no citoplasma é uma boa ideia para preparar uma amostra de controlo não extraído.
   1. As células cultivadas sobre lamínulas são preparadas como acima (ver seção 2.2), exceto que a etapa de extração digitonina (2.2.3) é ignorado.
   2. Após a fixação, as células não-extraídos devem ser permeabilizadas em PBS + 0,1% de TritonX-100 durante 15 min à temperatura ambiente.

3. Coloração FISH

1. Concepção de sondas para hibridação in situ fluorescente
   1. A sequência primária do mRNA de interesse é dobrada utilizando RNA software predição estrutura secundária, tais como RNAstructure 5,0 ^18. As dobras de mRNA são avaliadas visualmente para identificar uma região de cerca de 50 nucleótidos, que é livre de grandes estruturas secundárias.
   2. O complemento reverso desta região é sintetizado com um fluoróforo ligado Alexa546 para a extremidade 5 'da sonda (adquirido a partir de Integrated DNA Technologies).
   3. A sonda é diluída com RNase isento de água a uma concentração de caldo de 100 | iM, que pode ser armazenado a -20 ° C.
2. A coloração com sondas FISH
   1. Note-se que embora as células digitonina extraídos não requerem a permeabilização adicional, o tratamento destas amostras fixadas com 2 ml de 0,1% de Triton X-100 diluído emPBS durante 15 min à temperatura ambiente antes da coloração FISH, ajuda a reduzir o sinal de fundo.
   2. Os slides são depois lavadas duas vezes com PBS para remover qualquer resíduo de paraformaldeído ou Triton X-100.
   3. As células são então lavadas duas vezes com 25% a 60% de formamida em 1X tampão de citrato de sódio (150 mM de NaCl e 15 mM de citrato de sódio). Geralmente, para sondas FISH específicos que são 50-60 nucleótidos de comprimento, de formamida a 60% é utilizada, mas para a coloração de ARNm de poli (A) com a sonda oligo FISH (dT), o nível de formamida é reduzida para 25%.
   4. Para preparar a câmara de coloração, o fundo de um prato de 150 milímetros de Petri é coberta com água e um pedaço de Parafilm é flutuou na água. A água é removido girando o prato por cima, permitindo assim que o parafilme a aderir ao fundo do prato. As bolhas de ar são removidos manualmente com kimwipes.
   5. Para cada lamela de serem coradas, pipetar uma gota 100 ul de solução de hibridação contendo a sonda de FISH de interesse para o parafilm na câmara de coloração. A sonda de FISH estoque é diluída com 25% de formamida a 60% em tampão de hibridação (1 x SSC, 100 mg / ml de sulfato de dextrano, 1 mg / ml de ARNt de levedura, complexo vanadil riboside 5mM, 25-60% de formamida) a uma concentração de trabalho de 0,2 uM. Note-se que a quantidade de formamida deve ser optimizada para a sonda em particular a ser utilizada, e está presente na mesma concentração que no tampão de lavagem SSC (ver o passo 3.3.3).
   6. A lamela é colocada com a face para baixo no lado da célula a solução FISH na câmara de coloração e foram incubadas durante 5-24 horas a 37 ° C numa câmara húmida, tais como a cultura de tecidos incubadora.
3. Lavagem e montagem das amostras coradas
   1. Para preparar uma RNase área de lavagem livre, fixar uma tira de parafilme em uma superfície plana, como uma mesa de laboratório. Para garantir que o parafilm é plana, a superfície molhada nível, coloque o parafilme em cima e remover manualmente as bolhas de ar com kimwipes.
   2. A câmara de coloração éremovida da incubadora e colocado sobre uma superfície plana. As lamelas são depois flutuou por pipetagem cerca de 500 ul de tampão de lavagem FISH perto da borda de cada lamela. A solução vai ser desenhado em entre as lamelas eo parafilme por ação capilar.
   3. Para cada lamela, 1 ml de tampão de lavagem (1x SCC com 25-60% de formamida, ver o passo 3.3.3) são pipetados para a zona de lavagem parafilme (ver o passo 3.4.1).
   4. Usando fórceps, as lamelas de cobertura são removidas da câmara de coloração e cada uma é colocada sobre a gota de tampão de lavagem e incubou-se à temperatura ambiente durante 5 min. O processo de lavagem é repetido três vezes.
   5. Lâminas de vidro são lavadas com etanol a 70% e secou-se com kimwipes.
   6. Para cada lamela, 25 ul de solução de montagem (DAPI Fluoromount G, Southern Biotech) é pipetado para o slide. Note-se que esta solução contém 4 ',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), o qual DNA manchas e permite a visualização dos núcleos.
   7. Usifórceps ng e kimwipes, a parte de trás da lamela é seco e de tampão de lavagem em excesso FISH é blotted fora sem secar a amostra. Cada lamela é então colocado com o lado das células para baixo, para a gota de solução de fixação.
   8. As amostras montadas são então marcados e pode ser armazenar a 4 ° C.

4. Imagem e Quantificação

1. Imagem
   1. Um microscópio de epifluorescência, é utilizada para a imagem das células após coloração de FISH. A célula transfectada podem ser diferenciados a partir das células não transfectadas pelo sinal de fluorescência brilhante no canal apropriado. Idealmente, cada campo adquirido também conterá uma célula não transfectada para ser utilizado para determinar a fluorescência de fundo para a quantificação.
   2. Para cada imagens de campo do Peixe e do canal DAPI são adquiridos. Além disso, se as células forem co-coradas com marcadores de proteína, uma imagem do canal de imunofluorescência é também adquirido. Note-se que a extracção digitonina também pode ser usadopara visualizar ER-bound ribossomas e proteínas ^11.
   3. Para assegurar que as intensidades de fluorescência entre os campos podem ser comparados entre si, o tempo de exposição para cada canal devem permanecer constantes para cada conjunto de experiências.
   4. Mais uma vez para assegurar que as intensidades de fluorescência entre as células em lamelas de diferentes podem ser comparados entre si, as mudanças do dia-a-dia de intensidade epiluminescence ou decaimento do sinal de FISH deve ser minimizada por imagem de todas as lamelas de cobertura em uma única sessão.
2. Quantificação. Para quantificar a quantidade de mRNA que é localizada no RE, que usa o software Nikon Elemento NIS. Contudo software de análise de imagem, tal como outros ImageJ pode ser usado.
   1. Usando o elemento NIS Nikon ferramenta de análise de imagem, a periferia da célula e do núcleo são descritos como região separada de Interesses (ROI).
   2. Para cada ROI, a intensidade de fluorescência (I _T para a intensidade total de células e para o _i nintensidade nuclear) ea área (A e _T A _N) são gravados e exportados para uma planilha Excel.
   3. Para cada imagem, a intensidade de fluorescência de fundo (I _B) é determinado com base na intensidade de uma célula não-transf ectada. Se os níveis de poli (A) do mRNA estão a ser analisados, uma área livre de células é seleccionado.
   4. A quantidade total de ER (em células extraídas) ou citoplasmático (em células não extraído) da fluorescência é calculada pela seguinte fórmula:
      [A _T] [I _T - Eu _B] - [A _N] [I _N - I _B]
   5. A intensidade da coloração nuclear também pode ser calculada e utilizada como controlo interno entre os vários tratamentos. Uma vez que os núcleos não são afectadas pelo tratamento digitonina ¹⁷ ou ruptura do ribossoma ^11, a quantidade de mRNA nuclear deve permanecer constante entre cada um desses tratamentos. Para calcular a fluorescência nuclear a seguinte fórmula é utilizada:
      [A _{N] [N} I - IB]
   6. A percentagem de ARNm citoplásmico que é ER-alvo pode ser calculada com base na fluorescência ER média de 30-40 células extraídas (ver 4.2.4), dividido pela média de fluorescência citoplasmática 30-40 células (não extraído novamente ver 4.2.4) . É fundamental que as células extraídas e não extraído são preparados, corados e fotografada em paralelo.

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Resultados

Para determinar a percentagem de mRNA que é ER-associado, células COS-7 que foram transfectadas com os plasmídeos que continham a fosfatase alcalina de placenta (ALPP) ou citocromo P450-8b1 (CYP8B1) ou foram extraídas com digitonina e, em seguida, fixo, ou fixo directamente (ver Figura 1, comparar "não extraído Ctrl" para "Extraído Ctrl"). A fluorescência não nuclear foi quantificada em ambas as amostras e a fracção de ER-associated mRNA foi calculado

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Discussão

A localização dos mRNAs para vários locais subcelulares, através da interacção com proteínas de transcritos de mRNA de localização, é um fenómeno generalizado importante para a triagem adequada de proteínas para o seu destino final, e para o ajuste fino da expressão de genes com os requisitos locais de uma subcelular região ^19,20.

Utilizando o ensaio aqui descrito, revisitamos a questão de se os ARNm que codificam para proteínas de secreção pode ser mantida no ER...

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