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Method Article
Drosophila melanogaster é um organismo modelo eficaz para explorar a base molecular da regulação da longevidade. Este protocolo irá discutir as etapas envolvidas na criação de um reprodutível, medição de base populacional de longevidade, bem como potenciais armadilhas e como evitá-los.
O envelhecimento é um fenômeno que resulta na deterioração fisiológica constante em quase todos os organismos em que foi examinado, levando à redução do desempenho físico e aumento do risco de doenças. Envelhecimento individual se manifesta ao nível da população como um aumento dependente da idade de mortalidade, que é muitas vezes medido em laboratório, observando vida em grandes grupos de indivíduos da mesma idade. Experiências que visam quantificar a extensão em que as manipulações genéticas ou ambientais impacto esperança de vida dos organismos modelo simples foram coroados de êxito para a compreensão dos aspectos do envelhecimento que são conservadas entre taxa e para inspirar novas estratégias para prolongar vida útil e prevenção de doenças associadas à idade nos mamíferos .
A mosca do vinagre, Drosophila melanogaster, é um organismo modelo atractivo para estudar os mecanismos de envelhecimento devido ao seu tempo de vida relativamente curto, a criação conveniente, e genética fáceis.No entanto, medidas demográficas de envelhecimento, incluindo a idade específica de sobrevivência e mortalidade, são extremamente suscetíveis a variações ainda menores em delineamento experimental e meio ambiente, e para a manutenção de práticas estritas de laboratório para a duração dos experimentos de envelhecimento é necessária. Estas considerações, juntamente com a necessidade de praticar o controle cuidadoso do fundo genético, são essenciais para a geração de medições robustos. Na verdade, há muitas controvérsias em torno notáveis inferência a partir de experimentos de longevidade em leveduras, vermes, moscas e ratos que foram traçadas a artefatos ambientais ou genéticos 1-4. Neste protocolo, descrevemos um conjunto de procedimentos que foram otimizados ao longo de muitos anos de medir a longevidade em Drosophila utilizando frascos de laboratório. Descrevemos também o uso do software DLIFE, que foi desenvolvido pelo nosso laboratório e está disponível para download ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / software). DLIFE acelera o rendimento e promove as boas práticas, incorporando melhor projeto experimental, simplificar a manipulação mosca e coleta de dados, padronização e análise de dados. Também vamos discutir as muitas armadilhas em potencial no projeto, coleta e interpretação de dados de expectativa de vida, e nós fornecemos medidas para evitar esses perigos.
Recomendamos armazenar alimentos experimentais, pasta de levedura e placas de agar de uva que aparecem no protocolo, a 4 ° C e utilizando-os dentro de 1-2 meses, desde que o molde e secura não tiver definido dentro das condições ambientais padrão, tanto para o larvar e adulto estágio envolve a manutenção de moscas em uma incubadora a 25 ° C com um ciclo de 12:12 horas de luz escura e 60% de humidade relativa.
1. Preparação de Alimentos Experimental
2. Preparação de uma pasta de levedura viva
Combine 5-6 ml de água com 3 g de levedura seca activa e misturar bem. A consistência da pasta de levedura deve ser a de uma manteiga de amendoim lisa.
3. Preparação de uma placa de agar de uva
4. Coleta de ovos sincronizados
Todos os meios utilizados no presente protocolo, isto é, de levedura, de placas de ágar de uva, CT e 10% de alimento SY, deve estar à temperatura ambiente.
5. Recolha de Idade de correspondência adulto voa
6. Classificando Moscas e configuração Experimento Longevidade
7. Configurando a planilha Excel para controlar o Experimento Longevidade
8. Manter o experimento Longevidade
Os frascos contendo alimentos frescos devem estar à temperatura ambiente para cada transferência.
9. Análise de Dados
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Um esquema simplificado do protocolo é apresentada na Figura 1, em que os passos principais são delineadas. A parte do protocolo de sincronização podem ser utilizados para ensaios diferentes que necessitam de moscas adultas pareados por idade.
As curvas de sobrevivência típicas de moscas do tipo selvagem são mostradas na Figura 2a, utilizando o software de gestão de DLIFE experiência (Figura 2b, c). Machos adultos geralmente vivem m...
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O protocolo aqui apresentado descreve um método para produzir medições reprodutíveis da longevidade da Drosophila, que é adaptável para a avaliação de intervenções farmacológicas, genéticos e ambientais. Aspectos cruciais do protocolo incluem controlando cuidadosamente o ambiente de desenvolvimento larval, minimizando o estresse do adulto, e minimizando o viés entre os grupos experimentais e controles. Apresentamos também a utilização do software de gestão DLIFE vida experiência. Por simplesme...
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Não há conflitos de interesse declarados.
Este trabalho foi suportado pelo financiamento do Medical Ellison Foundation (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) e NIH R01AG030593 (SDP). Este trabalho utilizou os recursos do Envelhecimento Drosophila Core (DAC) do Centro de Choque Nathan de Excelência em biologia do envelhecimento financiado pelo Instituto Nacional do Envelhecimento P30-AG-013283 ( http://www.nih.gov/ ). Os autores gostariam de agradecer ao Laboratório Pletcher para discussões úteis e particularmente Brian Chung para a leitura crítica do manuscrito. Nós gostaríamos de agradecer Nick Asher e Kathryn Borowicz para a assistência com a coleta de dados.
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
Levedura seca ativa | Fermento Fleishmann de | 2192 | |
Premix em Pó Uva Agar | Genesee Científico | 47-102 | |
Gaiolas grande coleção de Embriões | Genesee Científico | 59-101 | |
Tampas grandes substituição | Genesee Científico | 59-103 | |
6 onças Praça Garrafas de fundo, de polipropileno | Genesee Científico | 32-130 | |
Tampas para garrafas Banco Flugs | Genesee Científico | 49-100 | |
DrosophilaFrascos, Geral, Polystrene | Genesee Científico | 32-117 | |
Closures Flugs para frascos largos | Genesee Científico | 49-101 | |
Largos Orifice Aardvark pontas de pipeta, 200 ul | Denville Científico | P1105-CP | |
Flystuff Flypad, tamanho padrão | Genesee Científico | 59-114 | |
BD Falcon 15 ml cónicas Tubos da centrífuga | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
Pratos Fisherbrand Petri com Tampas Limpar, levantou cume, 100 OD x 15 mm H; | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
Kimax * Colorware frascos 1000 ml amarelo | Fisher Scientific | 10-200-47 | |
PBS pH 7,4 10x | EmVitrogen | 70011044 | |
Agar Gelidium | Mooragar | n / a | |
Levedura de Cerveja | Biomedicals MP | 0290331280 | |
Açúcar granulado | Kroger | n / a | |
Tegosept | Genesee Científico | 20-266 | Fly conservante de alimentos |
Ácido propiónico, 99% | Acros Organics | 149300025 | Fly conservante de alimentos |
Sulfato de canamicina | ISC BioExpress | 0408-10G | |
Tetraciclina HCl | VWR | 80058-724 |
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