Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

Resumo

Experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios são essenciais para a capacidade do cérebro de se adaptar em resposta aos desafios comportamentais. Um In vivo Dois fótons método de imagem é descrito aqui que permite o acompanhamento de tais alterações moleculares em individuais neurônios corticais através de repórteres codificados geneticamente.

Resumo

A capacidade do cérebro de mudar em resposta a experiência é essencial para a função saudável do cérebro, e anomalias no presente processo contribuem para uma variedade de desordens cerebrais ^1,2. Para melhor compreender os mecanismos pelos quais os circuitos cerebrais reagem a experiência de um animal requer a capacidade de monitorar as alterações dependentes da experiência molecular em um dado conjunto de neurónios, ao longo de um período de tempo prolongado, em que o animal vivo. Embora a experiência e atividade neural associada é conhecido por desencadear mudanças de expressão gênica em neurônios ^1,2, a maioria dos métodos para detectar tais mudanças não permitir a observação repetida dos mesmos neurônios durante vários dias ou não tem resolução suficiente para observar neurônios individuais ^{3 , 4.} Aqui, descrevemos um método que combina in vivo de dois fótons de microscopia, com um repórter fluorescente geneticamente codificado para rastrear experiência dependentes de mudanças de expressão gênica em neurônios corticais individuais sobre o claro do dia-a-dia experiência.

Uma das bem estabelecidas experiência dependentes de genes é regulada Atividade proteína associada citoesqueleto (Arco) ^5,6. A transcrição do arco é rápida e altamente induzida pela intensificação da actividade neuronal ^3, e do seu produto de proteína regula a endocitose de receptores de glutamato e de longo prazo de plasticidade sináptica ^7. A expressão do arco tem sido amplamente utilizada como um marcador molecular para mapear os circuitos neuronais envolvidas em comportamentos específicos ^3. Na maioria destes estudos, a expressão Arc foi detectada por hibridação in situ ou imuno-histoquímica em secções de cérebro fixos. Embora esses métodos revelaram que a expressão do arco foi localizada para um subconjunto de neurónios excitatórios após experiências comportamentais, como os padrões de expressão celular do arco pode mudar com múltiplos episódios de experiências repetidas ou distintivo mais dias não foi investigada. ntent "> in vivo de dois fótons de microscopia oferece uma poderosa forma de examinar a experiência adquirida dependentes de alterações celulares no cérebro vivo ^8,9. Para permitir a análise de expressão Arc em neurônios vivos por dois fótons de microscopia, que anteriormente gerou um knock- na linha de rato em que um repórter GFP é colocado sob o controle do promotor endógeno do arco ^10. Este protocolo descreve as preparações cirúrgicas e procedimentos de imagiologia de seguimento experiência dependentes de padrões de expressão de Arc-GFP em conjuntos neuronais do animal vivo. Neste método , crónicas janelas cranianas foram primeiro implantado em ratinhos Arc-GFP nas regiões corticais de interesse. Estes animais foram então repetidamente fotografada por dois fotões microscopia após desejados paradigmas de comportamento ao longo de vários dias. Este método pode ser geralmente aplicável a animais portadores outros repórteres fluorescentes de experiência dependentes de alterações moleculares ^4.

Protocolo

Os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Instituto Nacional de Atenção à Saúde Mental Animal e Comitê de Uso e estavam de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Preparação pré-operatória

1. Limpe todas as ferramentas em um esterilizador quente talão antes da cirurgia asséptica, limpar o local da cirurgia com etanol 70%, e colocou panos limpos. Usar luvas estéreis. Anestesiar os animais com uma solução preparada de fresco avertina a 1,2%, determinado a 0,02 ml / g, por via intraperitoneal. Alternativamente, anestesiar com gás isofluorano por meio de um cone de nariz, 5% para indução, 1,5% para a manutenção, com um circuito eliminador passiva. Verifique o nível de anestesia com pitadas cauda ou dedo do pé para garantir sedação plena.
2. Cobrir os olhos do animal com pomada oftálmica estéril, e injectar a dexametasona preparado de fresco (0,2 mg / kg) e carprofeno (5 mg / kg) subcutaneously para evitar inchaço e inflamação do cérebro ^11. Raspar o cabelo sobre o crânio entre as orelhas, e esterilizar a pele com esfoliação betadine e três compressas alternadas de etanol 70%.
3. Montar o animal num estágio cirurgia estereotáxica com earbars, com uma almofada de aquecimento de água de circulação abaixo do conjunto de animais, a 37 ° C. Verifique regularmente os níveis do animal de anestesia, e complementar a dose do anestésico original conforme necessário.
4. Injectar 200 ul de Marcaine 0,5% sob a pele do couro cabeludo para anestesiar a área. Faça uma incisão na pele e remover a retalho de pele sobre o crânio. Retire o periósteo e secar a área com compressas de algodão limpo.

2. Cirurgia Janela crônica craniana

1. Use uma broca de alta velocidade dental com 0,5 milímetros de rebarbas suavemente para delinear um círculo de diâmetro 3-5 mm sobre a região do cérebro de interesse. Periodicamente molhar o local de perfuração com pó de osso estéril 0,9% e limpar com cotonetes limpos. Se os sangramentos ósseas, use gelfoam previamente embebidos com solução salina estéril para apagar o sangramento e esperar por ele para parar.
2. Quando a camada último osso é atingido, levantar e remover a ilha osso com uma pinça de ponta fina. Dura anexos à prateleira inferior do osso pode ser encontrado se a janela atravessa uma sutura óssea. Estes devem ser cuidadosamente removidos como a aba de osso é levantado.
3. Rolo de espuma umedecido gel suavemente sobre a dura exposta para limpar a sua superfície e esperar por qualquer sangramento dural parar passo crítico:. Não prossiga até que todo sangramento dural parou. Sangue que fica preso dentro da janela craniano geralmente leva a uma janela opaca.
4. Se a região de interesse é em um local em que a dura-máter é particularmente espessa, a remoção da dura-máter acima, pode ser necessário. Se este for o caso, separar o suavemente dura a partir do pia abaixo com uma pinça muito finas, fazer uma pequena incisão na dura levantada com outro par de fórceps finos, então agarrar as extremidades cortadas e suavementedividir a dura-máter. A duração é fina, mas forte, por isso tome cuidado para não cortar o cérebro com as bordas intactas da dura.
5. Lavar a área com ACSF estéril ou soro fisiológico estéril.
6. Coloque uma lamela de vidro esterilizada (3-5 mm) sobre a dura-máter ou pia passo crítico:. Se as curvas em torno do crânio significativamente, usar Kwiksil adesivo ¹² para encher os espaços em que a dura-máter ou pia não fazem contacto estreito com a lamela em regiões que não vai ser trabalhada.
7. Use gel de cianoacrilato para cobrir o adesivo elastómero e as bordas da lamela de vidro. Cobrir todo o crânio exposta com gel de cianoacrilato, ou uma mistura de cimento e krazyglue dental passo crítico:. Não permitir que qualquer gel de cianoacrilato de tocar a superfície do cérebro.
8. Incorporar uma custom-made barra de metal de fixação da cabeça do lado oposto do crânio.
9. Reexpedição para uma câmara de recuperação quente, depois de uma injecção intraperitoneal de cetoprofeno, 5 mg / kg, for gestão da dor. Continuar o analgésico por mais dois dias de pós-operatório.
10. Após duas semanas de recuperação pós-operatória, anestesiar o animal com isoflurano (5% para indução, de 1,5% para manutenção), montá-lo em um estágio do microscópio custom-made com um quadro de cabeça de fixação, e verificar a janela craniana para claridade óptica sob iluminação com luz azul. Cérebro superfície clareza vaso sanguíneo é altamente indicativo de qualidade janela craniano. Se as extremidades dos vasos sanguíneos são bem definidas, a janela é susceptível de ser utilizável. A duas semanas de tempo de recuperação pós-operatório é recomendado para permitir tempo suficiente para que o animal a recuperar da cirurgia. Janelas cranianas tipicamente limpar e melhorar durante este tempo, e permanecem opticamente transparentes por semanas adicionais para meses até rebrota de crânio ou espessamento da dura degrada a qualidade da janela.

3. Protocolo de comportamento e de varredura a laser de dois fótons Microscopia

1. Animais com c clarajanelas ranial serão expostos a um estímulo ambiental ou submetidos a uma sessão de treino comportamental, e, em seguida, depois trabalhada no momento de expressão da GFP Arc-maximal. Antes de iniciar um protocolo de comportamento, o animal deve ser mantido num ambiente doméstico consistente gaiola para minimizar dia-a-dia da variação dos níveis de linha de base do arco GFP-expressão.
2. Começar a formação comportamental ou paradigmas de estimulação ambientais, dependendo da região do cérebro de interesse. Por exemplo, animais podem ser expostos a diferentes ambientes visuais em dias consecutivos, e visualizados por dia após a estimulação visual para identificar estímulo respostas específicas do córtex visual ^10.
3. Arc-GFP em neurónios fluorescência tipicamente atinge o seu nível máximo de duas horas após a estimulação. A linha do tempo experimental pode ser otimizada para facilitar a detecção de Arco GFP-expressão em neurônios em seus níveis máximos de fluorescência.
4. Depois de uma sessão de formação comportamental ou environmental estimulação é completado, anestesiar os animais com isoflurano (5% para indução, de 1,5% para manutenção) e montar o animal na platina do microscópio sob medida com a cabeça de fixação do quadro sob o microscópio de dois fotões.
5. A posição da cabeça do animal é fixado à armação da cabeça de fixação, que liga directamente à fase, utilizando-se a barra de metal implantados no crânio. Isoflurano e oxigénio são continuamente fornecidos ao rato através de um cone de nariz. A temperatura do corpo é mantida através de uma almofada de aquecimento.
6. Certifique-se que os detectores de microscópio são protegidos da luz ambiente através da realização de dois fótons de varredura a laser em um quarto escuro. Use uma lente de imersão de 20x ou 25x (1,05 abertura numérica) de água para geração de imagens. Primeiro, sob epi-fluorescência iluminação, adquirir uma imagem da superfície padrões dos vasos sanguíneos mais a região do cérebro de interesse com uma câmera CCD para o alinhamento da imagem futuro.
7. Comece dois fótons de varredura a laser para adquirir uma pilha de imagens 3-D. Um FV1000 OlympusMPE microscópio multi-fotão é usado em nossa configuração. A excitação comprimento de onda do laser de dois fotões está fixado em 920 nm, e a potência do laser emitido da objectiva é de cerca de 50 mW. Fluorescência emitida é detectada simultaneamente nos canais de verde e vermelho espelho dicróico (a 570 nm, filtro de barreira de 495-540 nm e 570-625 nm), usando um externo de dois canais do sistema de detecção photomutiplier colocados próximo do espécime. Arco-GFP fluorescência só aparece no canal verde, enquanto que o tecido auto-fluorescência aparece em ambos os canais ^{13, 14.}
8. Pilhas de imagens típicas têm dimensões de cerca de 320x320x100 ^ m (comprimento x largura x profundidade), uma resolução horizontal de 0,5 m / pixel e uma resolução vertical de 3 mm / pixel.
9. Depois de adquirir a pilha de imagens, o animal regressar à sua gaiola. Não perturbe o animal até a próxima comportamental e sessão de imagem. Repita o comportamento e procedimento de imagem em dia como desejáveled. Use o cérebro adquiridos anteriormente superfície da imagem vaso sanguíneo para orientar volta para o local de imagem mesmo.

Resultados

Este protocolo descreve um método para rastrear experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios corticais individuais em animais vivos. Uma janela crónica craniana é primeiro criado sobre uma região cortical de interesse num rato carregando um repórter fluorescente da expressão do gene. Dois fotão-microscopia pode então ser acoplado com vários paradigmas de comportamento para observar comportamentalmente induzidas alterações moleculares em neurónios individuais e rastrear tais mudan...

Discussão

O método de imagem in vivo descrito aqui permite o exame repetido de mudanças Arco de expressão de genes nos mesmos conjuntos de neurônios durante vários dias no animal vivo. É um método eficiente e versátil para a obtenção de informação sobre a plasticidade neural relacionadas com a dinâmica molecular em neurónios individuais em resposta a várias experiências comportamentais. Padrão métodos histoquímicos como a hibridização in situ e imuno pode conseguir uma única célula resolu?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do Equipamento	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
FV1000 multi-fotão microscópio de varredura a laser	Olimpo	FV1000MPE	Imagem
Microscópio de dissecção	Omano	555V107	Cirurgia
Stereotaxis fase cirurgia para ratos	Harvard Apparatus	726335	Cirurgia
20X 25X ou objetiva de imersão de água	Olimpo	XLPL25XWMP	Imagem
Estágio do microscópio com cabeça de fixação de quadro	Feitos	N / A	Imagem
Pinça fina	Belas Science Tools	11251-20	Cirurgia
Dental broca rebarba	Belas Science Tools	19007-05	Cirurgia
Câmera CCD	QImaging	QICAM 12 bits	Imagem