A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

Resumo

Complexos proteína de catalisar as funções celulares importantes. Caracterização estrutural e funcional detalhada de muitos complexos essenciais exige a produção recombinante. MultiBac é um sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para a expressão de proteínas eucarióticas e seus complexos. MultiBac foi implementado como uma plataforma de acesso aberto, e procedimentos operacionais padrão desenvolvidos para maximizar a sua utilidade.

Resumo

Proteômica pesquisa revelou a complexidade impressionante de proteomas eucarióticas em detalhes sem precedentes. É agora um conceito geralmente aceite de que as proteínas nas células principalmente não existem como entidades isoladas, mas exercem a sua actividade biológica, em associação com muitas outras proteínas, em seres humanos dez ou mais, formando as linhas de montagem na célula para a maior parte, se não todas as funções vitais. ^{1 , 2} Conhecimento da função e arquitetura destes conjuntos multiprotein requer sua prestação em qualidade superior e quantidade suficiente para uma análise detalhada. A escassez de muitos complexos de proteínas nas células, em particular em eucariotas, impede a sua extracção a partir de fontes nativas, e requer a produção recombinante. O sistema de vector de expressão de baculovirus (BEVS) provou ser particularmente útil para a produção de proteínas eucarióticas, a actividade da qual assenta o processamento pós-translacional que outros sistemas de expressão vulgarmente utilizados, muitas vezes podenão suporta. ^três BEVS usar um baculovirus recombinante no qual o gene de interesse foi introduzido para infectar culturas de células de insectos, que por sua vez produzem a proteína de escolha. MultiBac BEVS é um que foi especialmente adaptado para a produção de complexos de proteínas eucarióticas que contêm várias subunidades. ⁴ Um pré-requisito importante para a produção eficiente de proteínas e os seus complexos são protocolos robustos para todos os passos envolvidos na expressão de uma experiência que, idealmente, pode ser implementado como procedimentos operacionais padronizados (POPs) e seguido também por usuários não-especializados, com relativa facilidade. A plataforma MultiBac no Laboratório de Biologia Molecular Europeu (EMBL) utiliza PHF para todos os passos envolvidos na expressão de um complexo multiproteico experiência, começando a partir da inserção dos genes num genoma de baculovírus engenharia optimizado para as propriedades de produção de proteínas heterólogas a análise de pequena escala da proteína exemplares produzidos. ^5-8 a plataformaestá instalado em um modo de acesso aberto no EMBL Grenoble e apoiou muitos cientistas de universidades e empresas para acelerar projetos de pesquisa complexos protéicos.

Introdução

A actividade biológica é controlada pela montagem de proteínas e outras biomoléculas que agem em conjunto para catalisar as funções celulares. Exemplos notáveis ​​incluem a maquinaria que transcreve a informação hereditária contida no DNA em RNA mensageiro. Nos seres humanos, mais de 100 proteínas em conjunto com um processo definido e regulado para transcrever os genes, formando grandes complexos multiproteicos com 10 e mais subunidades, incluindo a RNA polimerase II e os factores de transcrição gerais, como TFIID, TFIIH e outros. ⁹ Outros exemplos são o ribossoma, que consiste em muitas proteínas e moléculas de ARN que catalisa a síntese de proteínas, ou o complexo do poro nuclear, que é responsável pelo transporte biomoléculas através do envelope nuclear em eucariotas. A dissecção de arquitetura e bioquímica detalhada de essencialmente todas as máquinas com múltiplos componentes da célula é vital para compreender a sua função. A elucidação da estrutura de procariotas e eukarribossomos yotic, por exemplo, constituíram eventos marcantes produzindo uma visão sem precedentes sobre a forma como estas máquinas macromoleculares realizar suas funções designadas na célula ^10,11.

Os ribossomas podem ser obtidos em termos de qualidade e quantidade suficientes para um estudo detalhado por purificação do material endógeno a partir de células cultivadas, devido ao fato de que até 30% da massa celular consiste de ribossomas. RNA polimerase II já é menos abundante em ordens de magnitude e, em muitos milhares de litros de cultura de levedura teve de ser processada para se obter uma vista atómica detalhada deste complexo central e essencial para a transcrição. ¹² A esmagadora maioria dos outros complexos essenciais estão presentes no entanto quantidades muito baixas em células nativas, e, portanto, não pode ser purificada de forma adequada a partir de material de origem nativa. Para produzir tais complexos acessíveis à análise estrutural e funcional detalhada exige a produção heteróloga recombinante usando TEchniques.

Produção de proteínas recombinantes teve um grande impacto na pesquisa de ciências da vida. Muitas proteínas foram produzidos de forma recombinante, e a sua estrutura e função dissecado na alta resolução. Programas de genômica estrutural aproveitaram a elucidação dos genomas de muitos organismos para enfrentar o repertório de organismos inteiros no modo de alto rendimento (HT), produto do gene. Milhares de estruturas proteicas foram assim determinados. Até à data, o sistema mais usado para prolífica produção de proteínas recombinantes tem sido E. coli, e diversos sistemas de expressão têm sido desenvolvidos e refinada ao longo dos anos, para a produção heteróloga neste hospedeiro. Os plasmídeos contendo uma variedade de funcionalidades, para permitir a produção de proteínas em E. coli preencher catálogos inteiros de provedores comerciais.

No entanto, E. coli tem certas limitações que o tornam inadequado para a produção de muitas proteínas eucarióticas e em pcomplexos de proteínas articulares com várias subunidades. Por conseguinte, a produção de proteínas em hospedeiros eucarióticos tornou-se cada vez mais o método de escolha nos últimos anos. Um sistema particularmente bem adequado para a produção de proteínas eucarióticas é o sistema de vector de expressão de baculovirus (BEVS) que depende de um baculovírus recombinante portador dos genes heterólogos para infectar culturas de células de insectos cultivadas em laboratório. O sistema é um MultiBac BEVS desenvolvidos mais recentemente, que é particularmente adaptado para a produção de complexos de proteínas eucarióticas com várias subunidades (figura 1). MultiBac foi introduzido pela primeira vez em 2004. ¹³ Desde a sua introdução, MultiBac tem sido continuamente refinado e fluxo alinhada para simplificar a manipulação, melhorar a qualidade da proteína-alvo e, geralmente, tornando o sistema acessível a usuários não especialistas através da concepção de procedimentos operacionais padronizados (POPs eficientes). ⁴ MultiBac foi implementada em muitos laboratórios em todo o mundo, em acAdémia e indústria. No EMBL em Grenoble, programas de acesso transnacionais foram postas em prática pela Comissão Europeia para fornecer treinamento especializado na plataforma MultiBac para cientistas que pretendiam usar este sistema de produção para avançar suas pesquisas. A estrutura e função de muitos complexos de proteínas, que até agora não eram acessíveis foi elucidada utilizando amostras produzidas com MultiBac. ⁴ No seguinte, as etapas de produção essenciais MultiBac estão resumidos nos protocolos como estão em operação na instalação MultiBac no EMBL Grenoble.

Protocolo

1. Tandem recombineering (TR) para a criação de MultiGene construções de expressão

1. Planejando a estratégia de co-expressão. Abordagem de projeto para inserir seus genes de interesse em doadores e receptores. Submódulos fisiológicas potenciais de seu complexo devem ser agrupadas em Aceitantes e Doadores específicas. Use Module multiplicação composta por endonuclease Homing (HE) - pares BstXI combinar cassetes de expressão em doador individual e plasmídeos Acceptor ^7,8 Criar todas as construções relevantes em silico e validar a estratégia cuidadosamente antes de prosseguir com o trabalho experimental.. Por exemplo, os genes de interesse deve ser verificado que não contêm HE ou outros locais de restrição e a presença de estruturas de leitura abertas (ORFs correctas) deve ser validado. Considere ordenação genes sintéticos otimizados para uso de códons célula de inseto e estrutura secundária do mRNA para melhorar os níveis de produção de proteínas, bem como a remoção de qualquer exipicar HE locais dos genes de interesse. Considere colocar etiquetas de purificação baseado em dados de literatura sobre N-ou flexíveis ou exposto C-Termini de suas proteínas de escolha. Considerar a aplicação de estratégias poliproteicos que visam a produção de várias subunidades da proteína em seu complexo se as quantidades relativas de proteínas individuais precisam ser controlados devido a problemas de estequiometria do complexo. ⁴ Prepare detalhado "How-To" documento (recomenda livro de laboratório eletrônico) contendo todas as etapas experimentais projetadas do projeto que levou à construção multigene completo (s). Criar arquivos eletrônicos dos Cre-LoxP plasmídeos fundidos, por exemplo, usando o software Cre-ACEMBLER que pode ser baixado a partir da home page do grupo Berger ( multiexpression_technologies www.embl.fr/multibac/ / cre-acembler ).
2. Insira seus genes de interesse em doadores selecionados eAceitantes, usando enzimas de restrição e ligase, ou, alternativamente, por meio de ligação métodos independentes seguintes protocolos publicados ^5,6,14. Se você tiver acesso a uma estação de trabalho de manipulação de líquidos e se você planeja um grande número de construções a serem gerados ( por exemplo, para abordagens combinatórias) considerar o uso de scripts de robótica desenvolvidos e implementados pelo grupo Berger (Figura 2). ^14,15 Se uma estação de trabalho de manipulação de líquidos não estiver disponível, a operação manual utilizando microplacas permite a inserção de genes em um HT como a moda.
3. Restrições impostas pela necessidade de controlar a estequiometria das subunidades expressas pode materializar. No caso de níveis de expressão desequilibradas estequiometricamente de unidades individuais de um complexo de proteínas, considerar a aplicação de estratégias poliproteicos conjugar várias subunidades do seu complexo e uma protease específica (por exemplo, tabaco etch virus Nia protease) em grandes ORFs individuais espaçadas de sSites proteolíticas ESPECÍFICAS. ^4,8 Considere co-expressando um ou vários poliproteinas com cassetes de expressão de solteiro, se você tem um grande complexo com várias subunidades e amplamente variando pesos moleculares das subunidades individuais. Considerar que co-expressam vários genes que codificam para a mesma proteína em uma poliproteína ou como várias cassetes de expressão idênticos se que a proteína é caracterizada por baixo rendimento de produção. ^4,13
4. Validar todos doador e receptor construções clonados por mapeamento de restrição (opcionalmente no high-throughput) e seqüenciamento. Prossiga para fundir combinações doador-aceitante por Cre-LoxP recombinação para gerar os multigênicas construções de expressão de escolha. Validar aceitador doador de plasmídeos de fusão purificou-se por mapeamento de restrição, utilizar sequências electrónicas criadas por Cre-ACEMBLER programas semelhantes ou como uma referência.
5. Guarde Doadores, aceitantes e fusões Donor-Acceptor purificados e validada a -20 ° C ou -80 ° C. Arquivo plasmids e suas seqüências (Microsoft Excel, FileMaker, outros) com cuidado para uso posterior.

2. MultiGene Composite Baculovirus Geração, amplificação e armazenamento

1. Integrar os vetores de transferência multigênicas genoma baculoviral MultiBac por se transformar em células DH10 abrigar o genoma viral e as funcionalidades requeridas para Tn7 transposição. Note-se que o genoma de baculovírus Multibac pode ser pré-carregado com os genes particulares de interesse (YFP marcador, chaperones, etc) no seu próprio sítio loxP (engenharia no genoma distal ao sítio de ligação do Tn7) in vivo por uma reacção anterior Cre Tn7 integração. Após ¹³ Tn7 transposição, as células com baculovírus compósito contendo os genes de interesse são seleccionadas por rastreio azul / branco (Tn7 resultados bem sucedidos de transposição em perda de α-complementação do β-galactosidase e, portanto, as colónias com correcta Tn7 transposição permanecem brancas sobre um selectivaplacas de gar contendo X-gal) e o genoma é preparado por lise alcalina e etanol / precipitação com isopropanol ^5,6.
2. A transfecção e produção de vírus inicial. Ponto de 6 poços na placa de cultura de tecido estéril capa. A partir da fase log da cultura de células de insecto Sf21, a semente alíquotas de células nos poços e transfecção por adição do genoma de baculovírus purificado e um reagente de transfecção misturados em meio de cultura, tal como descrito. ⁶ Colheita de vírus inicial após 48-60 horas, removendo os meios de comunicação ( de alta qualidade, de baixo título do vírus V _0, tipicamente de 3 ml por cavidade). Suplemento meios frescos e de ensaio para a produção de proteína (e, se um marcador YFP está presente, por fluorescência), após um período adicional de 2-3 dias ^6,7.
3. Amplificação do vírus, baixa MOI regime. Usar V ₀ vírus de infectar 25-50 ml de células em fase logarítmica (densidade celular <1x10 ⁶ células por ml) em pequenos (100-250 ml) agitador frascos Erlenmeyer agitadosem crivos de plataforma orbital (Figura 3). Contagem de células e dividi cada 24 horas até as células param de duplicação (proliferação de prisão). Seguir um regime de baixa MOI (multiplicidade de infecção ou seja, o número de partículas de vírus por célula): As células devem dobrar (pelo menos) uma vez (MOI <1), caso contrário, repetir experimento com um menor volume de V ₀ adicionado. Normalmente, 3 ml de ₀ V são utilizados para infectar 25 ml de células de insecto Sf21, a uma densidade de 0.5x10 ⁶ células / ml. Isto é essencial para evitar prejudicial sobre-amplificação e de auto-eliminação de vírus que pode resultar na perda dos genes heterólogos de interesse. Colheita V _um vírus (25-50 ml), após 48-60 horas por peletização células e remover a mídia que contém o vírus. Suplemento com novas mídias e ensaio de YFP e produção de proteínas através da remoção de 1x10 ⁶ células a cada 12 ou 24 horas, peletização e validar a produção de proteína e (YFP) sinal proteína marcadora. ^6, Amplify vírus (paraV ₂₎ mais se volumes maiores de expressão visam infectando-se às células 400 ml em 2 L shaker frascos com _um vírus V respeitando acima baixa MOI regime (células deve dobrar pelo menos uma vez após a infecção com V _1). Rigorosamente testar a produção de proteína e proteína marcadora de sinal durante a amplificação para evitar o acúmulo de vírus defeituosos não contendo seus genes de interesse. ^5-7 Uso pellets de células que se acumulam a cada amplificações passo já para o estabelecimento de protocolos de purificação para o complexo de proteína expressa de interesse.
4. Armazenamento BIIC produção de vírus. É altamente recomendável para armazenar V ₂ do vírus como o vírus da produção usando o BIIC (B aculovirus-i i nfected nsect ells c) método para prevenir as modificações (por exemplo, a perda do gene de interesse) do vírus recombinante e para preservar a expressão elevada nívels ¹⁶ células infectadas pelota 24 horas após a prisão proliferação é observado -. Neste estágio as células contêm partículas virais completas antes que eles seriam libertados (por brotamento) nos meios de comunicação. Remova a mídia e alíquotas de congelar o pellet celular em nitrogênio líquido e armazenar indefinidamente. ^7,16

3. Produção de proteína e Processamento Downstream

1. Infectando grandes culturas (r) e monitoramento YFP. Usar V _1, V ₂ ou BIIC alíquotas congeladas para infectar culturas de células maiores para corridas de produção (tipicamente de 400 ml em frascos de 2 L). Aderir à baixa MOI regime (ajustar o volume do vírus utilizado para a infecção de modo que a cultura infectada duplica, pelo menos uma vez). Ampliar volumes de cultura infectados, se necessário, pela multiplicação do número de frascos. Se YFP proteína marcadora está presente, retirar-se em intervalos de 1x10 ⁶ células definidas, granulada e lisar as células e monitorar a evolução do sinal YFP até um platô é atingido indicating máxima produção da proteína recombinante. Níveis de YFP pode ser medida num leitor de placa de 96 poços padrão capaz de gravar sinais de fluorescência (p. ex SPECTRAFluor Tecan). Células colheita nesta fase. Loja de pellets de células a -20 ° C (curto prazo) ou -80 ° C (longo prazo).
2. Lise celular e fracionamento. Lisar as células por seu método favorito de escolha, adaptado às necessidades de sua proteína (congelamento e descongelamento, ultra-som, imprensa francesa, outros). Cytosol fracionar ^5-7 e núcleos e teste para a presença de suas proteínas de interesse. Desenvolver protocolos de purificação com base nos resultados para simplificar a purificação de proteínas. Considere a aplicação de procedimentos de imersão para extrair sua proteína da fração nuclear em condições de KCl elevados se os seus proteínas residem no núcleo. ^7,18
3. Purificação de proteínas (em grande escala micro-escala). Note-se que muitas vezes pequenos volumes (10 ou 25 ml) de cultura de células são sufficient para a obtenção de peletes celulares para purificar quantidades substanciais das suas proteínas de interesse devido aos tipicamente elevados ou muito elevados níveis de produção de proteínas heterólogas nos sistemas de células de baculovirus / insecto (geralmente 10-100 mg de proteína por L de cultura e mais). Em conjunto com micro-purificação (placas de vários poços, métodos MicroTip, sistema ÄKTAmicro GE Healthcare, outros), é possível obter dados bioquímicos e atividade e muitas vezes também quantidade suficiente de proteínas desejadas e complexos para nanoliter escala cristalização de alto rendimento (HTX ). Considere o uso de purificação de afinidade com metal (Clonetech Takara TALON, resinas quelantes de metais NiNTA Qiagen) e um oligo-histidina (resíduos 6-10) de etiquetas sobre subunidades expostas da sua proteína complexos para facilitar a purificação, conjuntamente com a troca iónica e cromatografia de exclusão de tamanho em pequenas volumes de, por exemplo, utilizando o ÄKTAmicro ou uma máquina de purificação pequeno volume semelhante (Figura 4 ). Outros passos de purificação por afinidade e troca iónica passos (IEX), além da purificação por afinidade, com as marcações de oligo-histidina ou outras marcações (escolha de GST, MBP, CBP e outras) podem e devem ser considerados, de acordo com as propriedades bioquímicas das proteínas de interesses e preferências individuais. Considere marcação mais do que uma subunidade, com marcadores de afinidade para melhorar a eficiência da purificação. Concentre seus complexos de proteínas purificadas e estabelecer protocolos de armazenamento, tais como o congelamento com ou sem glicerol. Desenvolver critérios de controlo de qualidade que possam ser aplicadas de forma padrão (ensaios de actividade, ensaios bioquímicos e biofísicos) para avaliar a variação das suas proteínas purificadas de lote para lote.

Resultados

Forte co-expressão de proteínas heterólogas obtidas pelo sistema MultiBac é mostrado na Figura 1D (sondas feita 48 horas após a infecção de uma cultura de células em suspensão). As bandas de proteína overexpressed são claramente discerníveis no extracto de células inteiras (SNP) e o ligado clarificado (SN). A qualidade e quantidade do material de proteína produzida é muitas vezes suficiente, para permitir a determinação da estrutura dos complexos de proteína, tais como o ponto de verif...

Discussão

Vídeo instantâneos nas Figuras 2 e 3 ilustram o processo inteiro de produção assistida por robô a partir do cDNA de expressão constrói multigenes todo o caminho para a infecção de culturas de células de insectos para a produção de proteína. Novos reagentes (plasmídeos e vírus) e os protocolos robustos têm sido desenvolvidos para permitir que uma conduta depender de PHF. Todo o oleoduto tem sido implementado como uma tecnologia de plataforma na EMBL, em Grenoble. A plataf...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bluo-Gal	Invitrogen	15519-028 (1 g)
Tetracycline	Euromedex	UT2965-B (25 g)	1,000X at 10 mg/ml
Kanamycine	Euromedex	EU0420 (25 g)	1,000X at 50 mg/ml
Gentamycine	SIGMA	G3632 (5 g)	1,000X at 10 mg/ml
IPTG	Euromedex	EU0008-B (5 g)	1,000X at 1M
Cre-recombinase	New England BioLabs	M0298
X-Treme GENE HP transfection reagent	Roche	06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect	Thermo Scientific	SH 30913.02
6-well plate Falcon	Dominique Dutscher	353046
2 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357507
5 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357543
10 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357551
25 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357535
50 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357550
50 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352070
15 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352096
1.8 ml cryotube Nunc	Dominique Dutscher	55005
100 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211917
250 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211918
500 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211919
2 L shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211921
Certomat Orbital Shaker + plateau	Sartorius	4445110, 4445233
Liquid nitrogen tank dewar 35 L	Fisher Scientific	M76801
Biological Safety Cabinet Faster	Sodipro	FASV20000606
Optical Microscope	Zeiss	451207
Sf21 Insect cells
Hi5 Insect cells	Invitrogen	B855-02
Tecan freedom EVO running Evoware plus	TECAN
10 μl conductive tips (black),	TECAN	10 612 516
200 μl conductive tips (black)	TECAN	10 612 510
disposable trough for reagents, 100 ml	TECAN	10 613 049
twin.tec PCR plate 96, skirted	Eppendorf	0030 128.648
96 well V bottom, non sterile	BD falcon	353263
96 deepwell plate color natural, PP)	Fisher	M3752M
PS microplate, 96 well flat bottom	Greiner	655101
96 deepwell plate	Thermo scientific	AB-0932
24 well blocks RB	Qiagen	19583
DpnI restriction enzyme	NEB	R0176L	20 U/uL
NEBuffer 4 10X	NEB	B7004S
2X phusion mastermix HF	Finnzyme	ref F-531L
2X phusion mastermix GC	Finnzyme	ref F-532L
DGLB 1.5X	homemade		7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF
High DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10496-016
Low DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10068-013
E-gel 48 1% agarose GP	Life Technologies	G8008-01
Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit	Macherey Nagel	740 708.24
PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract	Macherey Nagel	740 707.2
Gotaq green master mix	Promega	M7113
T4 DNA polymerase, LIC-qualified	Novagen	70099-3
DTT 100 mM	homemade
Urea 2 M	homemade
EDTA 500 mM pH 8.0	Homemade
LB broth (Miller) 500 g	Athena ES	103