Eletroporação Zona Neonatal subventricular

Resumo

Nós demonstramos uma técnica minimamente invasiva referido como eletroporação zona neonatal subventricular. A técnica consiste em injectar o DNA de plasmídeo nos ventrículos laterais de bebés recém-nascidos e na aplicação de corrente eléctrica para fornecer e manipular geneticamente as células estaminais neurais

Resumo

As células estaminais neurais (NSC) linha dos ventrículos laterais pós-natais e dão origem a vários tipos de células que incluem neurónios, astrócitos e células ependimais ^1. Entender os caminhos moleculares responsáveis ​​pela NSC auto-renovação, compromisso e diferenciação é fundamental para aproveitar o seu potencial único para reparar o cérebro e entender melhor sistema nervoso central. Os métodos anteriores para a manipulação de sistemas de mamíferos necessário o esforço demorado e caro de engenharia genética a nível animal inteiro ^2. Assim, a grande maioria dos estudos têm explorado as funções de moléculas NSC in vitro ou in invertebrados.

Aqui, nós demonstrar a técnica simples e rápida para manipular NPCs neonatais que é referido como neonatal eletroporação subventricular zona (SVZ). Técnicas semelhantes foram desenvolvidos há uma década para estudar NSCs embrionárias e ajudaram estudos sobre Cortical desenvolvimento ^3,4. Mais recentemente, esta foi utilizada para estudar o prosencéfalo roedor pós-natal ^5-7. Esta técnica resulta em rotulagem robusto de SVZ NSCs e seus descendentes. Assim, pós-natal SVZ electroporação proporciona uma alternativa de custo e de tempo eficaz para a engenharia genética de mamíferos NSC.

Protocolo

Este procedimento está em conformidade com os requisitos de Yale IACUC. Os cientistas devem se certificar de que as orientações IACUC são aprovados e seguido de acordo com as suas necessidades institucionais.

1. Seção 1. Preparação do Pipetas de DNA, Soluções e vidro

1. Gerar alta pureza (OD 260/280> 1,80) elevada concentração (ug / uL> 2,5) endotoxinas sem DNA.
2. Preparar solução salina 0,9% e filtrar através de um filtro estéril uM 22.
3. Colocar 10 centímetros de fogo polidas tubos capilares de vidro de borosilicato (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) em um modelo de PP-830 PC-10 Narishige pipeta de vidro com um puxador de fio de Kanthal. Definir puxador para puxar uma etapa uma ponderada em 70,5 ° C. Quebrar dicas com fórceps circulares e inspecionar sob um microscópio de dissecação para as bordas recortadas. Dicas de bisel e coloque sob uma lâmpada UV por 15 min. Pipetas puxados deve ser marcado menos 2 mm a partir da borda da ponta.
4. Prepare 0,1% em peso / volume rápido verde solutipela mistura estéril filtrada solução salina 0,9% com o verde de secagem rápida.

2. Seção 2. Preparação Animal, vidro Pipeta Carregando e Injeção plasmídeo

1. Remover dia pós-natal 0-1 filhotes individualmente a partir de gaiolas, lugar para uma placa de Petri de vidro pré-refrigerada a 4 ° C, e depois colocar em gelo húmido.
2. Após aproximadamente 5 minutos, determinar o estado de anestesia, utilizando a resposta pitada pé. Se nenhum movimento ocorre, filhotes sujeitos à injeção intraventricular.
3. É importante notar que a combinação de verde rápido, DNA, e solução salina podem resultar na rápida evaporação, cristalização, e o bloqueio de pipetas de vidro. Por isso, gerar uma solução estoque e ul alíquota 1-2 para parafilme imediatamente antes da injecção.
4. Aspirar todo o volume alíquota com a pipeta de vidro puxado.
5. Segure a cabeça do filhote entre o polegar eo dedo indicador de sua mão menos dominante.
6. Ligue uma lâmpadad segurar a cabeça do filhote de cachorro do lado de fora do feixe de luz. Se necessário, colocar sobre a cabeça de salina para reduzir a quantidade de luz reflectida por pup. Os ventrículos agora deve ser iluminado.
7. Com sua mão dominante, inserir a agulha no ventrículo lateral mais próxima de você (Figura 1A e 1B). O local de injecção deve ser de aproximadamente equidistante da sutura lambdóide e olho e 2 mm lateral da sutura sagital. Insira pipeta puxado para a marca de 2 mm para uma pup P0, que deve assegurar a penetração no interior do ventrículo lateral. Coincidentemente, você pode ver de volta o preenchimento do QCA na pipeta da liberação da pressão intracraniana. Para reduzir a pressão intracraniana, o que ajuda a injeção do plasmídeo, afrouxar seu aperto na cabeça do pup.Step 2.8. Injectar cerca de 0,5 ul de plasmídeo no ventrículo lateral, usando um injector de ar sob pressão (Picospritzer, Parker).

3. Seção 3. Eletroporação e Recuperação

1. Set a tensão do gerador de electroporação para 5 impulsos quadrados, 50 ms / pulso de 100 volts, com intervalos de 950 mseg. A especificidade espacial de electroporação plasmídeo é ditada pela direccionalidade de transferência de carga. Uma atenção especial é dada à colocação dada a heterogeneidade da população de células-tronco ao longo da SVZ ^8. Diferenças nas taxas de proliferação e destino da célula foram identificados para locais ventral-dorsal e rostral-caudal ^9,10.
2. Uma vez que o plasmídeo é injectado, dip eléctrodos pinça em PBS. Este passo é o de maximizar a transferência de carga e para impedir queimaduras provocadas pela resistividade.
3. Coloque o eléctrodo positivo sobre a parede dorsal lateral do filhote perto da orelha ipsilateral para o local da injecção de plasmídeo (Figura 1C e 1D). Coloque o eletrodo negativo no hemisfério contralateral ventral lateral para o filhote do focinho.
4. Iniciar a transferência atual pressionando as foots pulsobruxa pedal e varrer os eletrodos dorsal para lateral usando ~ 25 ° de ângulo intervalos.
5. Lugar electroporado crias num bloco de aquecimento durante 5 min. Gire gentilmente filhotes a cada 30 seg com estimulação leve.

Resultados

Neonatal resulta zona subventricular electroporação na rotulagem de quase todos glia radial contígua com a zona subventricular dorsal, dorsal lateral, e o movimento lateral, seguindo "varrer" do eléctrodo de pinça (Figura 1E). No entanto, a electroporação pode ser adaptado para as necessidades do respectivo ensaio, mas não varrer o eléctrodo e utilizando a colocação e orientação específica, conforme detalhado no vídeo. Por exemplo, uma vez localizada dorsalmente glia radial dife...

Discussão

Aqui nós detalhe a técnica de electroporação SVZ neonatal, uma técnica para rapidamente e de forma robusta e rotular manipular as células-tronco SVZ e seus descendentes. Há várias vantagens que tem a electroporação, em comparação com outras técnicas. Em primeiro lugar, dada a marcação focal de células, é capaz de discernir celulares autónomos e não autónomos efeitos célula. Manipulação, segundo genética utilizando sistemas indutíveis permite comparar o efeito antes ou após integração sinápti...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Tubulação Polido pesado borosilicato	Instrumento Sutter	BF150-110-10
Dual-Stage Vidro Micropipeta Puller	Narishige	PC-10H
Fast Green	Fischer Scientific	0521192205
ECM 830 Praça da onda de pulso gerador	Harvard Apparatus	45-0052
Tweezertrodes	Harvard Apparatus	45-0488
Fibra Óptica Fonte de Luz	Fisher Scientific	12-562-36
Halogênio de tungstêniolâmpada	USHIO America, Inc	1002247
Picospritzer II	Parker Instruments	052-0312-900