Protocolo melhorado para microdissecção a laser de ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos

Resumo

Microdissecção a laser é uma técnica que permite a recuperação de células selecionadas a partir de pequenas quantidades de parênquima. Aqui descrevemos um protocolo de aquisição ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos para serem utilizados para estudos de transcriptomic. Nosso protocolo melhora a autofluorescência intrínseca das células beta humanas, facilitando assim a sua coleção.

Resumo

Microdissecção a laser (LMD) é uma técnica que permite a recuperação de células e tecidos seleccionados a partir de quantidades diminutas de parênquima ^1,2. As células dissecadas pode ser usado para uma variedade de investigações, como estudos transcriptomic ou proteômica, avaliação ou análise de ADN cromossómico ^2,3. Uma aplicação especialmente difícil de LMD é a análise de transcriptoma, o qual, devido à instabilidade do ARN ^4, pode ser particularmente importante quando as células são dissecados a partir de tecidos que são ricos de RNases, tais como o pâncreas. Um protocolo de microdissecção que permite a identificação rápida e recolha de células-alvo é essencial nesta configuração, a fim de encurtar o tempo de tratamento do tecido e, consequentemente, para assegurar a preservação do RNA.

Aqui descrevemos um protocolo para a obtenção de células beta pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos para serem utilizados para estudos de transcriptomic ^5. Pequenos pedaços de pâncreas de cerca de 0,5-1 cm ³ foram cortados a partir das margens saudáveis ​​constantes de espécimes pâncreas extirpado, embebidos em composto Tissue-Tek OCT, imediatamente congelados em 2-metilbutano, refrigerada e armazenado a -80 ° C até que o corte. Quarenta secções seriadas de 10 um de espessura foram cortadas num criostato com uma configuração de -20 ° C, transferidas individualmente para lâminas de vidro, secou-se no interior do criostato durante 1-2 min e armazenado a -80 ° C.

Imediatamente antes do procedimento de microdissecção a laser, as secções foram fixadas em frio de gelo, preparada de fresco de etanol a 70% durante 30 segundos, lavou-se por 5-6 depressões em gelo água tratada com DEPC a frio, e desidratado por duas incubações de um minuto em gelo 100% frio etanol seguido de xileno (que é utilizado para a desidratação do tecido) durante 4 min; secções de tecido foram então secos ao ar depois de 3-5 min. Mais importante ainda, todos os passos, excepto a incubação em xileno, foram realizadas utilizando geladas reagentes - uma modificação ao longo de um protocolo previamente descrito ^6. Utilization de reagentes geladas resultou num aumento acentuado da autofluorescência intrínseca das células beta, e facilitado o seu reconhecimento. Por microdissecção, quatro secções foram desidratadas de cada vez: dois foram colocados em um tubo de ml embrulhado em papel alumínio 50, para proteger o tecido da humidade e de branqueamento, os dois restantes foram imediatamente microdissecados. Este procedimento foi realizado utilizando um instrumento PALM MicroBeam (Zeiss) empregando a pressão Laser Auto Catapulting (AutoLPC) de modo. A conclusão da célula beta / dissecção ilhota a partir de quatro criocortes necessários não mais do que 40-60 min. As células foram recolhidas para um AdhesiveCap e lisadas com 10 ul de tampão de lise. Cada amostra de RNA simples para análise transcriptomic foi obtida através da combinação de 10 amostras de células microdissecadas, seguido por extracção de ARN usando o Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Este protocolo melhora a autofluorescência intrínseca das células beta humanas, facilitando assim o seu reconhecimento rápido e preciso e collection. Melhorar ainda mais este procedimento poderia permitir que a dissecção das células beta fenotipicamente diferentes, com possíveis implicações para uma melhor compreensão das mudanças associadas com o diabetes tipo 2.

Protocolo

1. Congelamento de tecido pancreático humano

1. Remover o tecido adiposo, vasos sanguíneos, nervos e não-parenquimatosa tecido com um bisturi e pinças, e cortar o tecido pancreático em pedaços (cubos de ~ 0,5-1 cm).
2. Coloque um pedaço de tecido pancreático, no centro de uma Cryomold e cobri-lo completamente com frio Composto outubro Tissue-Tek. Coloque a Cryomold em um frasco cujo fundo está coberto com pré-arrefecida 2-metilbutano e de encaixe por congelação em azoto líquido. Armazenar a amostra congelada a -80 ° C.

2. Preparação de cortes congelados

1. Usar luvas durante todo todas as medidas para evitar a desnaturação do RNA.
2. Limpe a faca criostato, porta-amostra e pincel com 100% de etanol frio e RNase Fora. Colocar o tecido congelado dentro do criostato.
3. Aguarde até que o tecido faca, e escova alcançar -20 ° C. Rotular o SuperFrost Além disso slides e pré-cool-los dentro da câmara do criostato enquanto esperapara o tecido para chegar a -20 ° C.
4. Aplicar o Tissue-Tek Composto outubro no suporte de amostra e colocar o tecido congelado em cima.
5. Uma vez que o Tissue-Tek Composto outubro está congelado cortar o cryoblock e remover qualquer excesso de Composto Tissue-Tek outubro com uma lâmina de barbear.
6. Corte um total de 40 uM consecutivos 10 fatias a partir do bloco de tecido pancreático. Além disso, recomendamos o corte de uma primeira fatia e meio para ser salvo para desenhos visão geral da seção de pâncreas que pode facilitar a identificação de ilhotas dentro das fatias durante o processo de microdissecção.
7. Transferir as secções da lâmina da faca para o centro de uma SuperFrost Além slides tocando a parte de trás da lâmina com o seu dedo (coberta com uma luva) para aquecer apenas a região em que a secção deve aderir.
8. Seca-se a 1-2 min secções dentro do criostato a -20 ° C, após o que os colocar dentro de uma caixa corrediça colocada em gelo seco. Armazenar as seçõesa -80 ° C.
9. Se necessário, limpe a lâmina da faca com toalhas de papel e álcool 100% frio.

3. Desidratação de cortes congelados

1. Preparar os Reagentes: verter 30 ml de etanol preparada de fresco de 70%, 30 ml de água tratada com DEPC, 2x30 ml de etanol a 100% e 30 ml de xileno em tubos de 50 ml (Falcon Cellstar); frio e manter todos os reagentes (excepto o xileno) em gelo.
2. Limpe o espaço de trabalho sob o capô, com 100% de etanol e RNaseZAP.
3. Processo de duas criocortes como se segue: fixar em gelo de etanol 70% frio durante 30 s, lava-se com 5-6 mergulhos rápidos em gelo de água tratada com DEPC a frio, duas vezes desidratar durante 1 min em etanol a 100% arrefecido em gelo, incubar durante 4 min em xileno à temperatura ambiente (25 ° C), e secar ao ar durante 3-5 min. Repita este passo com outro par de criosseções.
4. Coloque duas criosseções secas volta para trás em um tubo de 50 ml Cellstar envolvido com folha de alumínio para protegê-los da luz e da umidade.

4. Microdissecção a laser de células-beta com PALM MicroBeam, Zeiss

1. Limpar o microscópio com RNaseZAP e montar o tampão adesiva no RoboMover.
2. Defina as seguintes configurações: SET FILTER 09 (excitação: 450-490 nm, 515 nm de emissão>), AutoLPC modo, a energia do laser de 50%, o foco do laser de 65%, 100% de velocidade a laser, 5 mM distância entre os disparos AutoLPC, 6 mM distância a linha, altura de trabalho: -10.100.
3. Insira um slide no palco.
4. Localize as células beta autofluorescente sob visualização microscópica (objetiva de 5x ou 10x).
5. Mudar para a lente de 40x, selecione as células beta com a ferramenta de seleção "Freehand" e microdissect-los utilizando o laser.
6. Capturar o tecido de quatro criocortes desidratados numa AdhesiveCap.
   Comentário 1: o tempo necessário para dissecar as células beta de um criocorte desidratado não deve ser superior a 10-20 min para evitar a re-hidratação das secções de tecido que resultaria emRNA degradação.
   Comentário 2: verificar processo microdissecção sucesso por inspeção visual depois de mover o palco para o ponto de verificação.

5. A lise das células do tecido microdissecado Beta Enriched

1. Remover o AdhesiveCap do RoboMover.
2. Pipetar 10 ul de tampão de extracção (XB, PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus) na tampa do AdhesiveCap e incubar de cabeça para baixo, a 42 ° C durante 30 min.
3. Girar a 10.000 xg e colocar o lisado em gelo seco. Armazená-lo a -80 ° C até a extracção de ARN é efectuada.
4. Repita os passos 3.) A 5.) Com todas as outras seções.

6. Extração de RNA

1. Misture todos os 10 lisados ​​10 uL
2. Prosseguir com o isolamento de ARN através do trabalho à temperatura ambiente de acordo com o protocolo do RNA PicoPure Isolation Kit, Arcturus, utilizando um rácio de 01:01 Tampão de Extracção (XB) a etanol a 70% (incluindo o tratamento de DNase).

7. RNA Análise

1. Use um RNA uL para análise da qualidade e quantidade usando um Agilent 2100 Bioanalyzer (Picochip). Avaliação quantitativa é feita em referência a um padrão de RNA carregadas em paralelo sobre o chip.

Resultados

Como mostrado na Figura 1, o protocolo modificado de desidratação levou a uma melhoria da autofluorescência células beta em relação ao protocolo anterior, publicado ^6. Aplicando o protocolo descrito, cada um dos 39 espécimes cirúrgicos pancreáticos foi usado para gerar 40 criocortes de série para uma média de ³ uM 31'544'704 espécime de tecido / pancreático (intervalo: 8'742'390 - 81'522'153 uM ³⁾ como mostrado na Tabela 1.

Discussão

Nós descrevemos uma abordagem confiável para a microdissecção a laser (LMD) de ilhotas de pâncreas humanos de uma amostra cirúrgica. Desde que um microscópio LMD está disponível, este procedimento poderia ser implementado em qualquer instituição de pesquisa realizando pancreatectomies parciais, aumentando assim o acesso ao material ilhota humana de ambos os não-diabéticos e diabéticos tipo 2. Isto é especialmente relevante dada a escassez de pâncreas oferecido para isolamento de ilhotas. Aspectos favorá...

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
2-metilbutano (isopentano)	ROTH	3927,1
AdhesiveCap (opaco, 500 ul)	ZEISS	415190-9201-000
Cellstar Tubes (50 ml)	Greiner Bio-One	210 261	com saia apoio
Cellstar Tubes (50 ml)	Greiner Bio-One	227,261
Pirocarbonato de dietilo (DEPC)	SIGMA	D 5758
Gelo seco
Etanol absoluto	VWR	20821.310
Nitrogênio líquido
Pincel
PALM MicroBeam	ZEISS
Descasque-a-Way incorporação moldes (truncada), 12 x 12 mm	ProSciTech	RR12	Milímetro superior interno 22x22, 21 mm de profundidade
Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit congelada	Applied Biosystems	KIT 0204
Braçadeira de plástico
Navalha
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254
RNaseZAP	SIGMA	2020 R
Bisturi /lâmina cirúrgica	Techno Corte	2800111
SuperFrost microscópio Plus, lâminas de adesão	Thermo Scientific	J1800AMNZ	25x75x1.0 milímetro
Tissue-Tek Composto outubro	Sakura	4583 ou 0807000022
Pinça	BRAUN	BD168R
Xileno	VWR	28975.291