De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase

Resumo

Apresentamos um método de triagem rápida e de baixo custo para a identificação de reguladores de transcrição usando de alto rendimento transfections robóticos e um ensaio de luciferase dual-brilho caseiro. Este protocolo gera rapidamente dados funcionais diretos side-by-side para milhares de genes e é facilmente modificável para atingir qualquer gene de interesse.

Resumo

Apresenta-se um protocolo rápido e barato de rastreio de alto rendimento para identificar reguladores transcricionais de alfa-sinucleína, um gene associado com a doença de Parkinson. As células 293T são transfectadas transitoriamente com os plasmídeos a partir de uma biblioteca de expressão de ORF formado, em conjunto com os plasmídeos repórter da luciferase, em um formato de um gene-por-microplaca. A actividade da luciferase do pirilampo é ensaiado após 48 horas para determinar os efeitos de cada biblioteca de genes mediante transcrição alfa-sinucleína, normalizadas para a expressão de uma construção de controlo interno (de um promotor de hCMV dirige a luciferase da Renilla). Este protocolo é facilitada por um robô de bancada fechado numa cabine de segurança biológica, que executa a manipulação asséptica líquido em formato de 96 poços. O protocolo de transfecção automatizado é facilmente adaptável para maior rendimento da produção de biblioteca lentiviral ou outros protocolos de rastreio funcionais que requerem triple-transfecções de um grande número de plasmídeos biblioteca original em conjunction com um conjunto comum de plasmídeos auxiliares. Apresentamos também uma alternativa barata e validado para comercialmente disponíveis, dupla reagentes luciferase que emprega PTC124, EDTA, e pirofosfato de suprimir a atividade da luciferase de vaga-lume antes da medição de Renilla luciferase. Usando esses métodos, nós analisamos 7.670 genes humanos e identificou 68 reguladores de alfa-sinucleína. Este protocolo é facilmente modificável para atingir outros genes de interesse.

Introdução

A capacidade de identificar elementos reguladores genéticos chave e os fatores que atuam sobre eles é fundamental para a exploração de numerosos processos biológicos. No entanto, a identificação de fatores que regulam a expressão de genes em tipos de células raras, como populações neuronais específicas, pode ser um desafio. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a identificação de novos reguladores transcricionais de alfa-sinucleína (SNCA), um gene associado com a doença de Parkinson e expresso em neurónios dopaminérgicos na substantianigra região pars compacta do mesencéfalo. Nós conseguimos isso usando uma tela repórter de alto rendimento, dual-luciferase, in vitro para desconstruir expressão alfa-sinucleína em células 293T. O promotor de alfa-sinucleína é primeiro clonado num plasmídeo repórter contendo o gene da luciferase do pirilampo. Um plasmídeo disponível comercialmente contendo a luciferase de Renilla sob o controlo de um promotor constitutivamente activo serve como um controlo interno. Tsconstruções repórter e são co-transfectados para células 293T em microplacas com plasmídeos de uma biblioteca de expressão de ADN, de modo a que cada poço é transfectada com um único plasmídeo biblioteca. Após 48 horas, a atividade de luciferase para cada repórter é medido sequencialmente através de um ensaio duplo-brilho. A expressão relativa de alfa-sinucleína em resposta a cada gene biblioteca é inferida pela relação de pirilampo: a actividade da luciferase de Renilla em cada poço (F: razão R) após normalização com base em placa.

Este protocolo prevê a possibilidade de um número elevado de genes (~ 2.500 por semana) por sua capacidade de transativar um gene repórter utilizando mão de obra mínima (1-2 pessoas) e um custo mínimo (cerca de US $ 3 Custo reagente por ensaio microplaca). Reguladores da transcrição de genes neuronais (por exemplo, alfa-sinucleína), que são difíceis de estudar em neurónios cultivados refractários a manipulação genética, podem ser comparados lado a lado no presente ensaio funcional directa. Nós incluímos em nossoprotocolo de um método detalhado para a clonagem e crescimento de plasmídeos contendo o promotor de alfa-sinucleína, uma vez que descobrimos que os plasmídeos contendo esta região são instáveis ​​quando cultivadas com procedimentos convencionais (ver discussão). Nós também incluímos uma alternativa barata para comercialmente disponíveis reagentes dual-luciferase para ensaios de alto rendimento. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para atacar outros elementos reguladores de interesse, ou para qualquer processo que requer a high-throughput transfecções transientes.

Protocolo

Para uma visão geral experimental, ver Figura 1.

1. Prepare plasmídeos repórter contendo a alfa-sinucleína Promotor

Os elementos reguladores do gene da alfa-sinucleína (Figura 2) abranger cerca de 10 kb, a montante do PNS (A-beta não componente de peptídeo amilóide) dinucleótido sequência de repetição ^{de 1,2} através de intrão 2 ^3. Nós incluem uma porção dessa região nossa construção repórter. Descobrimos que plasmídeos contendo intron 2 necessários procedimentos especiais para o crescimento, como descrito abaixo. Os plasmídeos de luciferase, e pGL4.10 pGL4.75 (Figura 3), encontram-se comercialmente disponíveis a partir de Promega e podem ser propagadas por meio de protocolos de biologia molecular convencionais.

1. Amplificar os dois componentes do promotor de alfa-sinucleína em PCR separadas utilizando a receita na Tabela 1 e os iniciadores na Tabela 2.
2. Verify produtos de PCR sobre um gel de agarose e limpos utilizando o kit de purificação PCR QIAquick (Qiagen), eluindo-se em 50 ul de TE (Tris-EDTA). Armazenar o eluído fragmento 0,9 kb a -20 ° C para uso futuro.
3. Digerir o volume total de 3,4 kb do fragmento de PCR, assim como 5 ug de pGL4.10, com Saci e Xhol. Tratar o vector com fosfatase alcalina de intestino de vitelo (Roche) e purificar em gel utilizando o kit de PureLink rápida Gel Extraction (Invitrogen).
4. Ligar o fragmento e o vector utilizando ADN-ligase de T4 (NEB). Limpar a reacção concluída, utilizando o kit de PCR PureLink Micro (Invitrogen), eluindo-se em 10 ul de tampão TE.
5. Transformar 2 ul do limpa, reacção de ligação em 20 ul de células competentes Electromax Stbl4 (Invitrogen) e electroporate acordo com as instruções do fabricante. Agitar em um de 30 ° C numa estufa a 225 rpm durante 90 min. Espalhe 2 volumes em placas de LB contendo 100 mg / ml de ampicilina e incubar a 30 ° C durante 2 dias.
6. Usando um palito, selecione 4-6 pequenas colônias para inoculação em 2 ml de TB (Terrific Broth). Crescer estas culturas miniprep num agitador de 30 ° C O / N.
7. Purifica-se o DNA de plasmídeo a partir de 1,5 ml de cada cultura utilizando o kit miniprep PureLink HiPure plasmídeo Miniprep (Invitrogen).
8. Digerir as minipreps com BamHI e electroforese em gel de agarose. O clone correta deve produzir fragmentos de 2,8 kb e 4,9 kb.
9. Restreak a cultura restante de miniprep a partir do clone correcto em LB (Luria Broth) placa fresca e crescer a 30 ° C durante 2 dias.
10. Selecione uma pequena colônia e inocular uma cultura inicial de 1,5 ml TB. Agite O / N a 30 ° C. Não deixe que a cultura inicial crescer a saturação.
11. Diluir toda a cultura de arranque em 150 ml de TB pré-aquecido e agitar a 30 ° C por 2 dias. Antes de prosseguir para o próximo passo, utilizar de 1,5 ml desta cultura para uma digestão adicional e miniprep para confirmar que o clone não se transformam durante replicati na.
12. Purifica-se o DNA de plasmídeo a partir da cultura restante, utilizando o kit Plasmid Maxiprep PureLink HiPure (Invitrogen). Rendimentos esperados deste plasmídeo intermediário são 50-150 mg por 150 ml de cultura.
13. Descongelar o fragmento de 0,9 kb congeladas na etapa 1.2. Repetir Passos 1,3-1,12 para clonar o fragmento de 0,9 kb no plasmídeo intermediário, digerindo vez com Kpnl e Saci. Ligadura, transformar, selecionar e crescer para maxipreps como acima. A digestão com BamHI deve originar fragmentos de 5,8 kb e 2,8 kb. Este é o plasmídeo que será utilizado para a tela.

2. Prepare células 293T, Repórter Plasmids e DNA Biblioteca de Triagem

As células 293T foram semeadas em primeiro lugar em placas de 96 cavidades e foram transfectadas no dia seguinte. Os plasmídeos repórteres e ADN de biblioteca são diluídos em placas de 96 poços. Obtivemos placas de biblioteca de DNA transfecção-grade a partir do DNA do núcleo no Massachusetts General Hospital (obter = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). Este protocolo transfects uma única chapa de biblioteca em duas placas idênticas de células 293T (Figura 1), assim, duas placas de células deveriam ser semeadas por cada placa de biblioteca a ser rastreada.

Nota: Cresça as células em meio sem vermelho de fenol ou antibióticos, uma vez que estes interferem com os ensaios de luciferase e aumentar a toxicidade durante a transfecção, respectivamente.

1. Para cada placa de biblioteca a ser rastreada, ressuspender as células 293T com tripsina a uma concentração de 1,5 x 10 ⁵ células / ml em DMEM contendo 14% de FBS. Despeje em um reservatório estéril (Axygen).
2. Coloque o reservatório, 2 de fundo claro, placas de 96 poços (Corning), e uma caixa de filtro de pontas de pipeta (Agilent) sobre o convés do robô. Pipetar 100 ul de células em cada poço de ambas as placas, para uma densidade de 1,5 x 10 ⁴ culas por po.
3. Centrifugar as placas de celulares a 50 xg por 2 min, usando baixas velocidades de rampa para garantir a igualdadedensidade celular ao longo de cada poço. Incubar a 37 ° C e 10% de CO ₂ S / N.
4. Diluir o pirilampo e Renilla plasmídeos repórter a 5 ng / mL em meio isento de soro. Combina-se as diluições em uma proporção de 05:03 de pirilampo para Renilla plasmídeo (em volume) em um tubo de 15 ml.
5. Pipeta os plasmídeos combinadas em cada poço de uma placa de 96 poços, a dosificação de 17 ul por placa biblioteca, mais excesso de 2-10 ul, a cada poço.
6. Obtenção de placas da biblioteca de ADN de transfecção grau como acima e diluir a 13,3 ng / mL com água isenta de endotoxina. O volume mínimo por poço deve ser de 28 mL.

3. Realizar transfecções

No dia 2 da tela, plasmídeos repórter e ADN de biblioteca são transfectados para células 293T.

1. Para cada placa de biblioteca, mistura de 107,5 ul de RT Optifect (Invitrogen) com 4,3 ml de meio isento de soro (diluição 1:40) em um tubo de poliestireno. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente, e on dispensar 44 ul (por placa de biblioteca) para cada poço de uma placa de 96 poços, de fundo V de poliestireno (Greiner).
2. Coloque a placa de diluído Optifect, plasmídeos repórter (Passo 2.5), DNAs biblioteca (Passo 2.6), e uma caixa de pontas de pipeta na plataforma do robô.
3. Aspirar 17 l de plasmídeos repórter, 43 mL de diluído Optifect, e 26 mL de DNA biblioteca, inserindo um espaço de ar 5 jul entre cada aspiração. O ADN da biblioteca devem ser aspirados última para evitar a contaminação cruzada. Dispense o conteúdo das dicas para uma nova placa de poliestireno-V fundo, misture, tampe e reserve por 20 minutos para permitir que os complexos de lipídios / DNA para formar. Se transfecção de múltiplas placas de biblioteca, substituir as pontas de pipeta e placa de biblioteca, e repita.
4. Descubra a placa de mistura Optifect / DNA e colocá-lo na plataforma do robô com 2 placas de células 293T. Usando uma única caixa de pontas de pipeta, aspirado 80 ml da Optifect: mistura de DNA e, lentamente, dispensar 40 mL em cada placa de células. Se transfecting múltiplas placas de biblioteca, repita para todos Optifect: placas de DNA. Cubra células.
5. Centrifugar as placas da célula de 1.200 xg durante 30 min. Cobrir e retornar para a incubadora.
6. Incubar as células por 4-6 horas. Durante esta incubação, preparar por meio fresco por mistura de 12 ml de DMEM contendo 10% de FBS e 10 ng / ml de ciprofloxacina (Cellgro) para cada placa transfectada biblioteca. Despeje meio fresco em um reservatório estéril.
7. Coloque 2 caixas de dicas robô, uma única placa de células, o reservatório contendo meio fresco, e um reservatório de resíduos para o convés do robô. Aspirar 100 ul de meio a partir das células e dispensar para o reservatório de resíduos parcialmente preenchido com etanol a 70%. Utilizando pontas frescas, aspirado de 100 ul de meio fresco e dispensar lentamente sobre as células. Repita o procedimento para todas as placas de células.
8. Retornar placas na incubadora durante 48 h.

4. Realizar luciferase dupla Ensaios

No dia 4 de tela, ovaga-lume e Renilla ensaios de luciferase são executadas.

Nota: O ensaio de luciferase dupla requer a adição sequencial de dois tampões de ensaio, 3X tampão de ensaio de pirilampo e Renilla tampão de ensaio 3X, como descrito na Tabela 3 do vaga-lume e luciferase Renilla não são segregadas, assim, as células devem ser lisados ​​antes de se medir a actividade da luciferase. . Tampão de ensaio de pirilampo lisa as células e proporciona substrato para a luciferase do pirilampo; tampão de ensaio de Renilla extingue o sinal de pirilampo e proporciona substrato para a luciferase de Renilla.

1. Para cada placa de biblioteca, preparar 8 ml de tampão 3X pirilampo ensaio a partir de soluções estoque como descrito na Tabela 3, e dispensar 82 mL em cada poço de uma placa de 96 poços de fundo em V.
2. Para cada placa de biblioteca, também preparar-se 12 ml de tampão de ensaio 3X Renilla e dispensar 122 mL em cada poço de uma placa de 96 poços de fundo em V. Ponha de lado tanto ovaga-lume e Renilla buffers ensaio.
3. Colocar uma caixa de pontas de pipeta, um reservatório de resíduos, e duas placas de células (transf a partir da mesma chapa de biblioteca) sobre o convés do robô.
4. Aspirar 60 ul de meio de cada placa e descartar no reservatório de resíduos parcialmente preenchido com etanol a 70%. Placas de cobertura e reserve. Se transfecção de múltiplas placas de biblioteca, repita para todos os conjuntos de placas.
5. Coloque 2 caixas de pontas de pipeta, a placa de 3X tampão vagalume ensaio, e um conjunto de placas de celulares na plataforma do robô.
6. Aspirar 40 ul de tampão 3X pirilampo ensaio e adicioná-lo à primeira placa de células, misturando cuidadosamente. Mudar para novas pontas de pipeta, repita o procedimento para a segunda placa celular. Colocar as células à temperatura ambiente durante 10 min para completar a lise. Se transfecção de múltiplas placas de biblioteca, substituir as caixas de sugestões e placas celulares, e repita.
7. Ficha de luminescência de cada poço da placa de células em cada um luminómetro, a gravação de um segundo por poço. Retornar placas ao robôdeck.
8. Colocar duas caixas de pontas de pipeta, a placa de tampão de ensaio 3X Renilla, e um conjunto de placas da célula no convés do robô.
9. Aspirar 60 ul de tampão de ensaio 3X Renilla, e adicioná-lo à primeira placa de células, misturando cuidadosamente. Mudar para uma nova caixa de pontas de pipeta, repita o procedimento para a segunda placa celular. Se transfecção de múltiplas placas de biblioteca, repita para todos os conjuntos de placas celulares.
10. Grave luminescência de todas as placas em um luminometer, registrando cada poço por 1 segundo acima. Descarte placas.

5. Análise de Dados

1. Calcule o vaga-lume: relação Renilla luminescência ("F: Relação R") para cada bem, dividindo as acusações de sinal de vaga-lume pelas acusações de sinal Renilla.
2. Calcular o valor de indução através da divisão do F: razão R de cada poço pela média F: relação R da placa, excluindo o mais alto e mais baixo de 25% dos poços.
3. Calcular a média dos valores de indução através de repetiçõespara uma única placa de biblioteca transfectadas. Genes induzindo ou reprimindo alfa-sinucleína mais de três dobras são considerados "hits" nesta tela e estão sujeitos a uma validação adicional e telas secundárias.

Resultados

Os valores típicos da luciferase, F: rácios R e os valores de indução para um único semi-placa são mostrados na Figura 4 Nota da batida no bem H2, um indutor de 32 vezes.. Genes que causam toxicidade excessiva (por exemplo, bem E3), ou poços que foram mal transfectadas, irá produzir valores baixos, tanto para vaga-lume e luciferases Renilla, mas um valor médio de indução. Os genes que causam indução não específica da actividade da luciferase, talvez através da interacç...

Discussão

Alfa-sinucleína foi implicada na doença de Parkinson (PD), como um componente de corpos de Lewy, ⁴ inclusões intracelulares considerados patognomónico para a doença. Numerosos estudos de associação do genoma ligaram polimorfismos de nucleotídeo único em alfa-sinucleína com risco aumentado para esporádica PD ^5,6,7. Embora menos comum do que a PD esporádica, PD familiar também pode ser causada por mutações em alfa-sinucleína ^8, bem como a duplicação e triplicação do loc...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
QIAQuick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K2100-12
PureLink PCR Micro Kit	Invitrogen	K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen	K2100-07
Bravo Robot	Agilent	-
Robot Pipet Tips with Filter	Agilent	19477-022
Robot Pipet Tips without Filter	Agilent	19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates	Corning	3610
Reservoirs	Axygen	RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651201
Adhesive Plate Covers	CryoStuff	#FS100
Reagent
Phusion DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
BAC 2002-D6	Invitrogen	2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase	Roche	10713023001
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202L
pGL4.10	Promega	E6651
pGL4.74	Promega	E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells	Invitrogen	11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265-017
DMEM without Phenol Red	Invitrogen	31053-028
Optifect	Invitrogen	12579017
Ciprofloxacin	CellGro	61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder	Sigma	93287
Tris-Base Powder	Sigma	93286
Triton X-100 Pure Liquid	Fisher	BP151-100
DTT	Invitrogen	15508-013
C–nzyme A	Nanolight	309
ATP	Sigma	A6419
Luciferin	Invitrogen	L2912
h-CTZ	Nanolight	301
PTC124	SelleckBiochemicals	S6003