Tratáveis ​​mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias

Resumo

Esta técnica proporciona um método para colher, normalizar e quantificar o crescimento intracelular das bactérias, que são pré-cultivadas em células hospedeiras naturais protozoários antes da infecção de células de mamíferos. Este método pode ser modificado para acomodar uma grande variedade de células hospedeiras para a fase de escorvamento, bem como tipos de células-alvo.

Resumo

Muitos agentes patogénicos bacterianos intracelulares, protozoários usar água doce como um reservatório natural para a proliferação no ambiente. Legionella pneumophila, o agente causador do legionário pneumonia, ganha uma vantagem sobre patogénico em bactérias cultivadas in vitro quando a primeira colheita a partir de células de protozoários antes da infecção de macrófagos de mamíferos. Isto sugere que os factores de virulência importantes não podem ser adequadamente expressas in vitro. Nós desenvolvemos um sistema tratável para o priming L. pneumophila através do seu hospedeiro natural protozoário Acanthamoeba castellanii antes da infecção de células de mamíferos. A contribuição de qualquer factor de virulência podem ser examinados, comparando o crescimento intracelular de uma estirpe mutante de tipo selvagem de bactérias depois de priming protozoário. Expressando GFP-L. de tipo selvagem e mutante estirpes pneumophila são utilizadas para infectar monocamadas de protozoários num passo de escorvamento e deixada atingir a fase tardia de crescimento intracelular. Bactérias fluorescentes são então colhidas a partir destas células infectadas e normalizados por espectrofotometria para gerar números comparáveis ​​de bactérias para uma subsequente infecção em macrófagos de mamíferos. Para quantificação, as bactérias vivas são monitorizados após a infecção através de microscopia de fluorescência, citometria de fluxo, e por plaqueamento de colónias. Esta técnica destaca e conta com a contribuição de anfitrião a expressão do gene de células-dependente, imitando o ambiente que seria encontrado em uma rota de aquisição natural. Esta abordagem pode ser modificado para acomodar qualquer bactéria que utiliza um hospedeiro intermediário como um meio para a obtenção de uma vantagem patogénico.

Introdução

Numerosos agentes patogénicos bacterianos adaptaram estratégias generalizadas de explorar as células hospedeiras para a sua sobrevivência e replicação num compartimento intracelular. Em muitos casos, os mecanismos patogénicos são semelhantes entre protozoários e metazoários células. No entanto, estes dois microambientes são muito diferentes e podem resultar em expressão diferencial de factores de virulência ^1-4. A doença dos legionários bactéria Legionella pneumophila é onipresente associada com ambientes de água doce em todo o mundo ^5. Importante, L. pneumophila cultivado em células de protozoários antes da infecção dos monócitos humanos ganhar uma vantagem patogénicas, o que sugere que os perfis de expressão gênica global da bactéria que sai de uma célula de protozoários são diferentes do que a do organismo cultivado in vitro em ^6-8. Na natureza, a água doce amebas fornecer nutrientes limita ricos para amplificação rápida de uma bactéria invasora. Aquisição humana de L. pneumophila é o mais frequentemente atribuída a inalação de gotículas de água contaminada que contém a bactéria. É provável que essas gotículas porto protozoários associados a células de bactérias, células de protozoários, onde são mais resistentes a práticas convencionais de tratamento de água ^9,10. Infecção de macrófagos alveolares do pulmão procede de uma maneira praticamente idêntica à do ciclo de vida da bactéria intracelular em células hospedeiras de protozoários ^11-13.

A fim de sobreviver e de se replicar em células eucariotas, L. pneumophila utiliza um tipo especializado sistema de secreção IVb denominado Dot / Icm para entregar cerca de 300 '"proteínas efectoras para o citosol da célula hospedeira ^14-16. Estas proteínas efectoras funcionar colectivamente subverter processos celulares, a fim de gerar um compartimento de replicação para a bactéria permissiva ^17,18. Deleções em qualquer um dos 26 genes que compreendem o resultado transportador Dot / Icm de estirpes defeituosas de mult intracelulariplication ^19-23. Historicamente, a deleção de genes individuais que codificam efetores raramente resultou em estirpes atenuadas para o crescimento intracelular. Esse fenômeno tem sido atribuída a várias hipóteses, incluindo função redundante e cópias parálogas de efetores.

Alguns factores de virulência são apenas expressas no contexto do hospedeiro associada a células de crescimento intracelular ^24. Nós racionalizado que se um efector específico foi expresso apenas no contexto da infecção por protozoários, em seguida, a contribuição do efector não pode ser comparada com uma estirpe de tipo selvagem, quando ambos foram cultivadas in vitro. L. pneumophila transições de um replicativa a uma fase transmissivo enquanto entra na fase estacionária da cultura ^25. O fenótipo de comutação fase representa o esgotamento de nutrientes encontrados durante crescimento intracelular e é exemplificada através de montagem de flagelos para a motilidade ^26. Porque L. pneumophila é mais invasive e virulenta quando colhido a partir de células de protozoários, buscou-se desenvolver um ensaio que mais fielmente representado o estado patogênico da bactéria quando encontrou macrófagos de acolhimento.

Para este fim, foi desenvolvido um ensaio de escorvamento versátil protozoário que pode acomodar qualquer hospedeiro adequado para ambos os primeiros (cell priming) e segunda (infecções de células alvo) de palco. O processo de infecção é tratável através da utilização de bactérias que expressam de forma estável a proteína fluorescente verde (GFP). O modelo de infecção pelo protozoário Acanthamoeba castellanii segue uma metodologia amplamente utilizado no campo ^27. Para o passo de activação, L. estirpes pneumophila são cultivados in vitro até à fase estacionária em meios líquidos para produzir rotulados 'transmissivos "bactérias (Figura 1A). As bactérias são depois utilizadas para infectar monocamadas de A. castellanii durante 18 horas para atingir uma fase tardia do ciclo de vida intracelular. Grandes vacúolos contêmbactérias ção pode ser visualizada nesta altura utilizando a microscopia de fluorescência (Figura 1A). As células são então lisadas por protozoários e bactérias recuperadas a partir do lisado são medidos para a emissão a 512 nm utilizando um leitor de placas de fluorescência. A fluorescência é proporcional à densidade óptica para calcular multiplicidade de infecção (MOI) durante a infecção das células alvo (figura 1, * Curva de correlação). Após invasão (T ₀₎ e 18 horas pós-invasão (T _18), as células alvo são quantificadas por fluorescência, que representa as bactérias intracelulares. A fluorescência pode ser monitorizada por microscopia e citometria de fluxo, e a contagem de viáveis ​​pode ser medido através de plaqueamento de colónias. O ensaio de priming é sempre acompanhada por infecções de tipo selvagem L. pneumophila e de uma estirpe deficiente em Dot / Icm sistema de secreção de tipo IV (Δ DOTA) (Figura 1A). Este importante fornece controles internos para comparações diretas entre um tipo selvagemnd quaisquer estirpes isogénicas mutantes utilizados no processo de infecção. A inclusão da estirpe avirulenta DOTA Δ durante a fase de escorvamento estabelece um limiar para a observação de fenótipos de crescimento atenuado associados isogénicas estirpes mutantes que são cultivadas in vitro.

Protocolo

1. Preparação das Culturas Legionella pneumophila para infecções Estágio Escorvante

1. Transformar toda L. estirpes pneumophila utilizados no ensaio com as pAM239 plasmídeo, que codificam uma isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) induzível da proteína verde fluorescente (GFP) ^28. Streak as estirpes bacterianas em ferro e de cisteína suplementado N-(2-Acetamido)-2-aminoetanossulfónico (ACES) tamponada carvão ágar com extracto de levedura (CYEA) contendo 6,25 ug / ml de cloranfenicol (CM) (para a manutenção do plasmídeo) e incubar durante 72 hr a 37 ° C.
2. Transferir um inoculo da estirpe bacteriana em ACES suplementados tamponada caldo de extracto de levedura (AYE) com 6,25 ug / ml de CM e IPTG 1 mM e cultivar até à fase estacionária (O / N) num agitador orbital a 37 ° C.
3. Confirmar a expressão da GFP em culturas in vitro, utilizando a microscopia de fluorescência. Transferem-se 10 ul de cultura sobre uma lâmina de vidro sob uma coberturadeslizamento e imagem através de uma objectiva 60X com excitação GFP / cubo de emissão (AMG EVOS fl).
4. Diluir uma alíquota de 100 ul de cada cultura in vitro utilizando a 1:10 estéril H ₂ O. Faça um branco usando 100 ul AYE media com IPTG 1 mM e 6,25 ug / cm ml e água. Tome OD600 medições das diluições usando um espectrofotómetro (Bio-Rad inteligente Spec Plus). Calcula-se o volume necessário para infectar um bem a um MOI = 20 para cada cultura in vitro: V = [(ameba seeded) x MOI] / [OD ₆₀₀ x (factor de diluição) x (constante)] = [(1 X 10 ⁶ ) x (20)] / [OD ₆₀₀ x (10) x (1 x 10 ^6)] = 2/OD _600. Concentração de bactérias é determinada como OD ₆₀₀ = 1,0 = 1 x 10 ⁹ CFU / ml.

2. Infecção Priming palco usando Acanthamoeba castellanii

1. Manter e cultivar as amebas em meio ATCC PYG 712 em 175 cm ² frascos de RT.
2. Substituir a mídia em cul amebasturas 24 h antes do início das culturas bacterianas de líquidos. No mesmo dia, líquidos culturas bacterianas são iniciados, recolha e contagem de células num microscópio de luz, utilizando um hemocitómetro.
3. Diluir as amebas com meio fresco para uma concentração final de 1 x 10 ⁶ células / ml. Semente 12 poços de células placas de cultura com alíquotas de 1 ml da amebas utilizando um pipetador de repetição e incubar à temperatura ambiente O / N.
4. Após incubação, lava-se os poços das placas de 12 poços de cultura de células 3x com 1 ml de PBS estéril através de uma pipeta de 10 ml serológicos e um auxiliar de pipeta manual.
5. Após a aspiração do PBS, adicionar 1 ml de meio de infecção (ATCC 712 media PYG menos glicose, peptona, extrato de levedura e) com IPTG 1 mM e 6,25 ug / ml cm a cada poço. Incubar as placas à temperatura ambiente durante 1 h.
6. Infect poços a um MOI = 20. Centrifugar a placa a 400 xg durante 5 min (Eppendorf 5810R) e flutuar num banho de água a 37 ° C durante 5 min. Transferir a placa para um de 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora durante 18 horas.
7. Confirmar as infecções usando imagens de células vivas em um microscópio de fluorescência antes de sediar a lise celular e colheita de bactérias.

3. Semeando células THP-1 para a Target Infecção estágio celular

1. (Comece este processo 24 horas antes de definir-se líquidos culturas bacterianas). Cultivar células THP-1 a 75, em cm ² frascos de cultura para quase-confluência em meio RPMI 1640 com 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS).
2. Contar as células em suspensão utilizando um hemocitómetro, diluir as células THP-1 em meio RPMI 1640 com FBS a 10% e 100 ng / ml de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) para uma concentração de 1 x 10 ⁶ células / ml , e prato em alíquotas de 1 ml em placas de 12 poços de cultura de células. Incubar as placas durante 48 horas a 37 ° C, 5% CO _2.

4. Transformação de bactérias para a Target Infecção estágio de célula após a infecção Estágio Priming

1. Aspirar a mídia da amebas preparado.
2. Lisam a ummoebae usando 500 ul de gelo frio, estéril de ultra-filtrado (UF) de H ₂ O e incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
3. O pool de lisados ​​de acordo com o tipo de estirpe e tomar uma medida _nm E ₅₁₂ para cada um dos lisados ​​agrupados utilizando um leitor de placas de fluorescência (Molecular Devices Spectramax Gêmeos EM).
4. Calcule um OD ₆₀₀ de medição para os lisados ​​agrupados: calcOD ₆₀₀ = 0,0008 (E ₅₁₂ - fundo lisado) + 0,0019. A fórmula foi previamente determinada representando graficamente uma comparação directa de ambos o OD ₆₀₀ e os E _{512 nm} medições de diluições de L. pneumophila GFP do tipo selvagem expressar de fase estacionária de cultura in vitro (Figura 1 *). Os lisados ​​de ameba não infectado, sujeitos às mesmas condições experimentais, a ameba infectada, são utilizadas como um espaço em branco, e desde um valor de correcção (por exemplo, fundo lisado), que foi incorporado na equação. O volume necessário tó infectar um bem a um MOI = 20 é calculada para cada pool de lisado: V = [(THP-1 sem sementes) MOI x] / [calcOD ₆₀₀ x (constante)] = [(1 X 10 ⁶⁾ x (20)] / [calcOD ₆₀₀ x (1 x 10 ^6)] = 20 / calcOD _600.
5. Lave as células THP-1 3x com PBS e adicionar 1 mL de RPMI fresco 1640 (10% de FBS) em cada poço. Incubar as células THP-1 durante 1 hora a 37 ° C, 5% CO _2.
6. Infectar as células THP-1 na MOI calculada usando os lisados ​​pool. Permitir que um conjunto de cavidades de não ficam infectadas, servindo como um controlo negativo para a análise de citometria de fluxo. Processamento da fase de escorvamento deve ser concluída em menos de 30 min. Os lisados ​​foram mantidos em gelo para limitar as alterações na expressão de genes de bactérias antes da infecção.
7. Centrifugar a placa, flutuar para aumentar a temperatura, e incubar como na fase de escorvamento.
8. Uma hora após a infecção, que remove o suporte por aspiração e lavar os poços 3x com PBS para remover as bactérias extracelulares.
9. Adicione 1 ml fresh RPMI 1640 (10% de FBS) aos poços e devolver a placa à incubadora. O tempo imediatamente após a troca de mídia serve como tempo zero (T _0). Incubar as células THP-1 de 14-16 horas a 37 ° C, 5% CO _2.

5. Análise Experimental

5,1 imagens de células vivas

Imagem cavidades infectadas, utilizando um microscópio de fluorescência (AMG EVOS fl) em 10X ou 20X de ampliação (Figuras 1A-D). As imagens podem ser comparadas, quer qualitativamente ou quantitativamente para determinar os níveis de infecção em ambas a fase de escorvamento e de infecções alvo estágio de células.

A citometria de fluxo 5,2

1. Os picos de emissão de infecções diferentes podem ser comparados através de citometria de fluxo (FACS Calibur BD). Tripsinizar as infectadas células THP-1 e gentilmente lavá-los a partir dos poços através da mistura em PBS com uma pipeta.
2. Reunir as células de tipo tensão em tubos Falcon de 15 ml e de pelotas a 1800 xg durante 2min na centrífuga de topo de mesa.
3. Suspender as pelotas em 1 ml de PBS e transferir para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. Centrifugar as suspensões a 1.800 x g (Eppendorf 5424) e re-suspender as pelotas em 1 ml de PBS. Se as suspensões resultantes são altamente turva (OD ₆₀₀ ≥ 1.0) eles devem ser diluídos em PBS adicional (1:3), para evitar o entupimento das linhas no citómetro de fluxo.
5. Use PBS estéril filtrada para equilíbrio do citómetro de fluxo e para as etapas de lavagem entre as injecções de amostra. Traça-se a dispersão para a frente / lateral de células alvo infectadas, antes da injecção de amostras-alvo da infecção das células.
6. Colete 20.000 eventos totais para cada condição utilizando 488 nm do laser de excitação e o canal FL1.
7. Portão populações de células pós-captura para excluir as células não infectadas e uma intensidade de fluorescência na trama de um histograma (FlowJo) (Figura 1E).

5,3 placas CFU

1. Examinar a eficiência of infecção por CFU plaqueamento das células recolhidas por citometria de fluxo. Preparar diluições em série das amostras de ultra-filtrada H ₂ O, 10 ^1, 10 ^-2, 10 ^-3 e.
2. Placa de 20 ul de cada diluição para 1/3 de uma placa CYEA com 6,25 ug / ml de CM.
3. Incubar as placas a 37 ° C durante 72 h.
4. Contar as colónias, usando um palito e contador de células.

Resultados

Um resultado típico para o processo de infecção toda está delineado na Figura 1. Viver micrografias de células de fluorescência mostrando monocamadas de A.castellanii infectadas com o tipo selvagem L. pneumophila durante a fase de escorvamento é mostrado na Figura 1A. Uma medida de sucesso da etapa de iniciação levaria a uma população de cerca de 90% das células hospedeiras que contêm grandes vacúolos preenchidos com bactérias marcadas com GFP neste MOI....

Discussão

A expressão do gene bacteriano é rigorosamente controlado por meio de uma combinação de progressão do ciclo de vida e resposta a sinais do micro-ambiente circundante. Patógenos vacuolares, tais como L. pneumophila responder a uma grande variedade de hospedeiros de células derivadas de pistas quando compartimentado em um fagossoma. Como resultado colectivo de exaustão de nutrientes na célula hospedeira, a bactéria compensa por expressar factores necessários para a difusão bem sucedida para uma célul...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	antibiotic
IPTG	Fisher Scientific	BP1755-10
ACES	Sigma	A9758-1KG	media component
ATCC medium: 712 PYG	ATCC		growth media for protozoans
1X PBS	Fisher Scientific	SH30256FS	phosphate buffered saline
activated charcoal	Fisher Scientific	C272-212	media component
yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	media component
peptone	BD Diagnostics	211677	media component
agar	Fisher Scientific	BP1423-2	media component
L-cysteine, 99%+	Acros organics	173601000	media supplement
Ferric nitrate nonahydrate	Fisher Scientific	I110-100	media supplement
Equipment
EVOS fl	AMG	EVOS fl	fluorescence microscope
Smart Spec Plus	Bio-Rad	170-2525	spectrophotometer
5810 R centrifuge	Eppendorf	22627023	bench top centrifuge
Repeater plus	Eppendorf	22230201	repeating pipette
SpectraMax Gemini EM	Molecular Devices		microplate reader
Softmax Pro 5.3	Molecular Devices	0200-310	microplate reader software
5424 microfuge	Eppendorf	22620401	table top microcentrifuge
Fast-release pipette pump II	Scienceware	379111010	pipette aid
FACS Calibur	BD Bioscience		flow cytometer
FlowJo 7.6.1	FlowJo	license	flow cytometery software
15 ml tube	BD Falcon	352096	polypropylene conical tube
1.6 ml microfuge tube	Neptune	3745.X	microcentrifuge tubes